伍 桐 馬雅軍

(1. 第二軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學部病原生物學教研室，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學研究生管理大隊，上海 200433)

許多傳病按蚊屬于種團或復(fù)合體的成員，中國的赫坎按蚊種團(Anopheleshyrcanusgroup)、微小按蚊種團(An.minimusgroup)和大劣按蚊復(fù)合體(An.diruscomplex)即是典型的例子，其成員種僅依據(jù)成蚊形態(tài)特征較難準確區(qū)分(陸寶麟等，1997)。對于按蚊種團或復(fù)合體隱種的鑒別研究始于上世紀20年代，從比較蟲卵特征、吸血習性和交配的不相容性開始，到觀察染色體核型等，發(fā)現(xiàn)了一些生態(tài)的、行為的、生化的和分子生物學的特征均為按蚊隱種鑒別提供了有益的證據(jù)。

業(yè)已證明，在用于蚊種鑒別的分子標志中，核糖體DNA第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Ribosomal DNA second internal transcribed spacer，rDNA-ITS2)序列特征是較為理想的標志(Collinsetal., 1996)，但也發(fā)現(xiàn)在近期分化的隱種間，其差異非常小，如岡比亞按蚊An.gambiae復(fù)合體的ITS2差異范圍為0.4%～1.6%(Paskewitzetal., 1994)，較難應(yīng)用。迄今，愈來愈多的蚊種ITS2序列被注冊到GenBank數(shù)據(jù)庫，筆者在整理和分析中國按蚊屬蚊種已注冊ITS2序列的基礎(chǔ)上，對其在鑒別中的應(yīng)用價值進行評述。因數(shù)據(jù)量較大，筆者將分為按蚊亞屬和塞蚊亞屬2個部分進行報告。

1 材料與方法

1.1 rDNA-ITS2序列信息

在GenBank數(shù)據(jù)庫中，以中國按蚊亞屬蚊種名為關(guān)鍵詞，搜索獲得所有登記的ITS2序列，進行統(tǒng)計和整理。

1.2 序列分析方法

將下載的所有序列，首先采用Clustal X軟件包進行對齊和比對分析，之后轉(zhuǎn)化為MEGA 5可識別文件，計算序列在種內(nèi)與種間的差異性(p-distance)。

2 結(jié)果

2.1 ITS2序列信息

截止2012年10月，GenBank中注冊的中國按蚊亞屬蚊種的ITS2序列共584條，隸屬20種(包括同物異名)、待定種5種和雜交種1個(表1)。

表1 中國按蚊亞屬蚊種在GenBank中的rDNA-ITS2序列信息(截止2012年10月)Tab.1 Nucleotide sequences of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Anopheles mosquitoes in the GenBank (by Oct. 2012)

續(xù)表1Tab.1continued

種類Species序列樣本信息Sequence featureGenBank登記號Accession number文獻References韓國Korea KLEK01GU384713-GU384716Joshi et al., 2010韓國KoreaDQ177501直接提交Direct submission韓國KoreaAY753740Li et al. 2005朝鮮按蚊An. koreicus中國ChinaAY523635Ma and Xu, 2005韓國KoreaDQ177500直接提交Direct submission貴陽按蚊An. kweiyangensis中國ChinaAF261150Ma and Xu, 2005昆明按蚊An. kunmingensis中國China KM1/AKM3AY170920Ma and Xu, 2005雷氏按蚊An. lesteri韓國KoreaEU789791Park et al., 2008a韓國KoreaGU384717-GU384722Joshi et al., 2010韓國KoreaAY375468-AY375469Wilkerson et al., 2003韓國KoreaDQ177502直接提交Direct submission中國ChinaAF384172Ma and Xu, 2005中國ChinaAY803792-AY803801Ma and Xu, 2005中國ChinaAJ004941.2馬雅軍等, 1998; 馬雅軍等, 2002; Ma and Xu, 2005韓國KoreaAJ620899-AJ620902Hwang, 2007日本JapanAB159606直接提交Direct submission涼山按蚊An. liangshanensis中國China KM2/AKM4AY170922Ma and Xu, 2005中國ChinaAF146750Ma and Xu, 2005林氏按蚊An. lindesayi 韓國Korea sub_species ja-ponicusAJ620898直接提交Direct submission韓國Korea sub_species ja-ponicusDQ398773Sames et al., 2008中國ChinaJX944708直接提交Direct submission米賽按蚊An. messeae俄羅斯Russia M-35species BHE659702直接提交Direct submission俄羅斯Russia M-50species AHE659703直接提交Direct submission俄羅斯Russia N-6species BHE659704直接提交Direct submission俄羅斯Russia Ch-1species AHE659705直接提交Direct submission俄羅斯Russia Ch-2species BHE659706直接提交Direct submission俄羅斯Russia A-1 species AHE659707直接提交Direct submission俄羅斯Russia A-22species BHE659708直接提交Direct submission英國Russia 3594NHMEF090193直接提交Direct submission瑞典SwedenEF090194-EF090196直接提交Direct submission羅馬尼亞Romania RO18-86NHMEF090197直接提交Direct submission羅馬尼亞RomaniaAY648982-AY648998直接提交Direct submission英國EnglandAY238412Di Luca et al., 2004荷蘭HolandAY238413Di Luca et al., 2004意大利ItalyAY238414-AY238419.2Di Luca et al., 2004黑山MontenegroAY238420.3Di Luca et al., 2004南斯拉夫YugoslaviaAY238421.4Di Luca et al., 2004哈薩克斯坦KazakhstanAY238422Di Luca et al., 2004俄羅斯RussiaFN646200-FN646219直接提交Direct submission德國、意大利、奧地利Germa-ny, Italy, AustriaAY365011Proft et al., 1999英國EnglandAF452699-AF452700直接提交Direct submission英國EnglandAF504197-AF504236直接提交Direct submission希臘GreeceAF342711-AF342712Linton et al., 2001伊朗IranAY050639直接提交Direct submission俄羅斯Russia 4kAM409762-AM409776直接提交Direct submission俄羅斯Russia 8xyAM409782-AM409799直接提交Direct submission哈薩克斯坦Kazakhstan DbAa20AJ783400直接提交Direct submission意大利Italy mesRI-AZ50105Marinucci et al., 1999中國ChinaAF305556馬雅軍等, 2001帶足按蚊An. peditaeniatus泰國ThailandAB539056-AB539063Choochote, 2011泰國ThailandHM488269-HM488271Paredes-Esquivel et al., 2011中國ChinaAY129958Ma and Xu, 2005

續(xù)表1Tab.1continued

種類Species序列樣本信息Sequence featureGenBank登記號Accession number文獻References中國ChinaAF543862Gao et al., 2004暗灰按蚊An. pullus韓國KoreaEU789792Park et al., 2008a中國ChinaJN865246-JN865249周曉俊等, 2011韓國Korea Form AAY444345Park et al., 2003韓國Korea Form BAY444346Park et al., 2003韓國KoreaGU384701-GU384706Joshi et al., 2010韓國KoreaAY170923-AY170924Ma and Xu, 2005韓國KoreaAF146749Ma and Xu, 2005韓國KoreaAY375470-AY375471Wilkerson et al., 2003韓國KoreaDQ177503直接提交Direct submission薩氏按蚊An. sacharovi伊朗IranAY114204-AY114211Sedaghat et al., 2003a, 2003b土耳其TurkeyAY238395Di Luca et al., 2004亞美尼亞ArmeniaAY238396-AY238399Di Luca et al., 2004阿塞拜疆AzerbaijanAY238400-AY238404Di Luca et al., 2004伊朗IranAY238405Di Luca et al., 2004希臘GreeceAF466745-AF466748直接提交Direct submission希臘GreeceAF485805-AF485810直接提交Direct submission希臘GreeceAF462077-AF462143直接提交Direct submission阿塞拜疆Azerbaijan 10-6FN665793直接提交Direct submission阿塞拜疆Azerbaijan 2-1FN665795直接提交Direct submission伊朗Iran NHM11434FJ210878Azari-Hamidian et al., 2009伊朗IranFJ210888-FJ210891Azari-Hamidian et al., 2009伊拉克IraqEU346646-EU346655直接提交Direct submission伊朗Iran Tg23DQ662410直接提交Direct submission伊朗IranDQ243825-DQ243828Djadid et al., 2007伊朗IranDQ243832-DQ243833Djadid et al., 2007伊朗Iran D13TAFAY842515Djadid et al., 2007伊朗Iran D9TAFAY842517Djadid et al., 2007希臘Greece 2586NHMAF469854直接提交Direct submission阿塞拜疆AzerbaijanAY100456直接提交Direct submission-AY365012Proft et al., 1999伊朗Iran AZ3103AF436062直接提交Direct submission土耳其TurkeyFN565570-FN565575直接提交Direct submission俄羅斯RussiaAM269899直接提交Direct submission伊朗Iran S120AY533852直接提交Direct submission意大利Italy sactu-A1Z83198.2Marinucci et al., 1999中華按蚊An. sinensis日本Japan Form AEU931611-EU931612Park et al., 2008a日本Japan Form BEU931613-EU931614Park et al., 2008a日本JapanAB159603直接提交Direct submission韓國KoreaEU789790Park et al., 2008b泰國ThailandHM488258-HM488259Paredes-Esquivel et al., 2011韓國KoreaGU384691-GU384696Joshi et al., 2010日本Japan SINJ01GU384697Joshi et al., 2010泰國Thailand SINT01GU384698-GU384699Joshi et al., 2010中國China SINC01GU384700Joshi et al., 2010韓國Korea Form BAY130469-AY130471Min et al., 2002泰國Thailand Form AAY130472-AY130473Min et al., 2002韓國KoreaWCKR_2AY130474Min et al., 2002韓國KoreaDQ177504直接提交Direct submission韓國Korea 1AY375464Wilkerson et al., 2003韓國Korea 1AY339278Hwang et al., 2006中國ChinaAF543861Gao et al., 2004中國China SMMU-SZGQ161923馬穎等, 2009中國China 2AY375465Wilkerson et al., 2003

續(xù)表1Tab.1continued

種類Species序列樣本信息Sequence featureGenBank登記號Accession number文獻References中國ChinaAY316154-AY316155Ma and Xu, 2005中國ChinaAY316156Ma and Xu, 2005中國ChinaAJ004942馬雅軍等, 1998; 馬雅軍等, 2002; Ma and Xu, 2005擬中華按蚊An. sineroides韓國KoreaEU789795Park et al., 2008a韓國KoreaGU384723-GU384725Joshi et al., 2010韓國KoreaDQ177505直接提交Direct submission韓國KoreaAJ620895直接提交Direct submission日本JapanAB159605直接提交Direct submission八代按蚊An. yatsushiroensis中國ChinaAY186791-AY186792Ma and Xu, 2005中國China YASCAY170925Ma and Xu, 20052An. sp.YM-2003a中國ChinaAY306128Ma and Xu, 2005#2An. hyrcanus group 泰國Thailand TR6HM488268Paredes-Esquivel et al., 2011An. sp.3.CPE-2010泰國Thailand TR3HM488272-HM488267Paredes-Esquivel et al., 20112An. hyrcanus group An. sp.LL1中國ChinaJX944687-JX944703直接提交Direct submission2An. hyrcanus group An. sp.LL2中國ChinaJX944704直接提交Direct submission2An. hyrcanus group An. sp.LL3中國ChinaJX944705-JX944707直接提交Direct submission3An. kleini×An. sinensis 韓國KoreaGQ265915-GQ265916Joshi et al., 2009

注：1同物異名An.lesteri, synonym ofAn.lesteri;2尚未訂名的種類, unnamed species;3雜交種, hybride; - 無測序樣本信息, no information of sequenced sample;§原文中為待定種An. sp. 2；The original paper as the unnamed speciesAn. sp. 2;#原文中為待定種An. sp. 1, The original paper as the unnamed speciesAn. sp. 1.

2.2 ITS2序列在種內(nèi)的差異

2.2.1中華按蚊: 已注冊ITS2序列的中華按蚊樣本來源于中國、日本、韓國和泰國，樣本信息描述包括中華按蚊A型和B型(Form)，此型是據(jù)染色體核型不同而確定(Baimaietal., 1993)，有學者純化培養(yǎng)了來自泰國和日本的中華按蚊兩型，以及韓國的B型，分別在實驗室雜交，結(jié)果顯示雜交的子代可育(Parketal., 2008b)。筆者比對了所有注冊的中華按蚊ITS2序列，結(jié)果顯示其間差異小于1%，泰國的中華按蚊A型(AY130472-AY130473)與其他序列間存在3處固定變異，而日本的中華按蚊A型(EU931611-EU931612)卻未見上述改變，提示中華按蚊的兩型目前在ITS2序列水平尚無法區(qū)分。

2.2.2八代按蚊與暗灰按蚊: 八代按蚊與暗灰按蚊的序列均由韓國和中國的學者注冊，有學者認為在韓國分布的八代按蚊是暗灰按蚊同物異名(Shinetal.，2001)，但因未與模式產(chǎn)地(日本Yatsushiro Kyushu)和中國的標本進行比較，故筆者將采自中國的樣本仍沿用八代按蚊的學名。

在已注冊ITS2序列的暗灰按蚊中，部分樣本信息描述為A型和B型，其差異僅表現(xiàn)在形態(tài)特征、生態(tài)習性和染色體核型，實驗室雜交能產(chǎn)生可育后代(Parketal., 2003)。將所有暗灰按蚊與八代按蚊的ITS2序列進行比對，發(fā)現(xiàn)除2條序列存在雙堿基突變外(JN865249和GU384702)，其他序列間的差異均顯現(xiàn)在2處兼并堿基位點，差異性小于0.5%。

2.2.3雷氏按蚊與嗜人按蚊: 雷氏按蚊與嗜人按蚊的分類地位經(jīng)多次反復(fù)修訂，現(xiàn)已公認嗜人按蚊是雷氏按蚊的同物異名(瞿逢伊，2008)，但在GenBank數(shù)據(jù)庫中仍存在未更新的嗜人按蚊ITS2序列(AJ620897)。已注冊ITS2序列的雷氏按蚊樣本來自韓國、中國和日本，比對后發(fā)現(xiàn)來自韓國樣本的4條序列(AJ620899-AJ620902)與其他序列間的差異大于8%(Hwang，2007)，故比對時需謹慎，剩余的序列間差異小于0.9%。

筆者早前文章中報告的“雷氏按蚊”(馬雅軍等，2000；Maetal., 2000; 馬雅軍等，2002)，在后續(xù)的研究中，發(fā)現(xiàn)鑒定有誤，即以“待定種”代表(Maetal., 2005; 瞿逢伊，2005)，后經(jīng)進一步研究比對，目前證實應(yīng)為比倫按蚊(馬穎等，2009；Rueda, 2005)。

2.2.4須喙按蚊: 須喙按蚊的序列目前已注冊112條，樣本來自印度尼西亞和泰國。來自印度尼西亞的須喙按蚊樣本描述分為5支(clade)，其中第Ⅳ與Ⅴ支，Ⅱ與Ⅲ支間的樣本序列幾乎無差異，而兩者間的差異性約為18%，第Ⅰ支與其的差異性約為23%和18%(Paredes-Esquiveletal., 2009)；來自泰國的樣本描述分為4個型(Form A/B/C/D)，依據(jù)染色體核型確定，而ITS2序列間的差異性可達40%，其間差異程度與染色體核型未發(fā)現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系(Saeungetal., 2007, 2008；Suwannamitetal., 2009)。迄今，來自中國的須喙按蚊樣本ITS2序列尚未注冊，故應(yīng)謹慎使用GenBank中的須喙按蚊ITS2序列。

2.2.5米賽按蚊: 米賽按蚊的序列目前已經(jīng)注冊有143條，樣本分別來自俄羅斯、英國、瑞典和中國等14個國家，比對所有的序列，其間差異性小于1%，差異最大的樣本均來自俄羅斯(AM409762-AM409776，AM409782-AM409799)和伊朗(AY050639)，注冊者為Bezzhonova和Djadid等。

2.2.6其他蚊種: 薩氏按蚊已注冊序列132條，樣本來自8個國家，其間差異性小于1%，中國的樣本尚無序列注冊。赫坎按蚊已注冊序列44條，樣本來自4個國家，其中1條序列(EF613293)與其他的序列差異性為1.3%(Djadidetal., 2009)，其余的序列間差異均小于1.0%。

另外，在整理已注冊按蚊亞屬蚊種的ITS2序列時，發(fā)現(xiàn)在中國分布的有4個序列類型未訂其學名，比對其序列，顯示與各類型相似度最高蚊種分別如下：YM-2003a與雷氏按蚊(84%)、 LL1與涼山按蚊(80%)、LL2與An.hyrcanusgroupAn. sp.3.CPE-2010(100%)、LL3與比倫按蚊(93%)。另外，韓國學者還注冊了中華按蚊與克萊按蚊雜交種的ITS2序列2條，分別與中華按蚊、克萊按蚊的相似性為100%(Joshietal., 2009)，筆者的實驗室也曾檢測到我國遼寧省野外存在的中華按蚊與克萊按蚊雜交種樣本。

除上述和僅注冊1條序列的蚊種外，其余的已注冊的ITS2序列的按蚊亞屬種內(nèi)差異性均小于0.5%。

2.3 ITS2序列在種間的差異

筆者選取在GenBank中注冊的中國按蚊亞屬種類的其中1條序列作為蚊種的代表，進行種間序列差異分析，結(jié)果顯示差異范圍為1.2%～69.5%(表2)，其中種間差異性小于3%的僅為昆明按蚊與涼山按蚊、八代按蚊與筠連按蚊,其余種間的差異性均大于5%。

表2基于GenBank數(shù)據(jù)庫中的中國按蚊亞屬部分種類種間rDNA-ITS2序列差異性

Tab.2 Interspecific variation of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Anopheles mosquitoes,according to GenBank database

1:An.lesteri_AJ004941; 2:An. sp YM-2003a_AY306128; 3:An.belenrae_AY187728; 4:An. sp. LL3_JX944705; 5:An.kleini_FJ875072; 6:An.sinensis_AJ004942; 7:An.kunmingensis_AY170920; 8:An.liangshanensis_AY170922; 9:An.kweiyangensis_AF261150; 10:An.sineroides_GU384723; 11:An. sp. LL1_JX944687; 12:An.junlianensis_AY316155; 13:An.yatsushiroensis_AY186792; 14:An.hyrcanus_AF261149; 15.An.crawfordi_AF261949; 16:An.peditaeniatus_AY129958; 17:An. sp. LL2_JX944704; 18:An.messeae_AF305556; 19:An.sacharovi_AY238405; 20:An.lindesayi_JX944708; 21:An.koreicus_AY523635; 22:An.barbirostris_AB435969.

3 討論

核糖體DNA是一個多拷貝基因家族，在細胞的多個轉(zhuǎn)錄單元中為一個或多個串聯(lián)陣列，陣列可位于相同或不同染色體上，每個rDNA的轉(zhuǎn)錄單元在蚊蟲中由3個基因、1個外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和2個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)組成，外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)互相連接rDNA。rDNA是遺傳信息的寶貴來源，功能區(qū)產(chǎn)生的核糖體高度保守，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列又具有較高的種間和種內(nèi)變異。諸多的研究，以及本文的分析顯示rDNA-ITS2序列的差異性在按蚊中具有良好的種內(nèi)保守性和種間解析度(Dixitetal., 2010)，但因序列間長度差異大，比對困難，故不適合更高階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。

筆者在整理GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的中國按蚊亞屬蚊種的ITS2序列時，發(fā)現(xiàn)仍有近1/3的、分布局限和無醫(yī)學重要性的種尚無序列注冊；在已注冊的序列中，由采自中國的樣本測定的序列數(shù)量也較少。提示中國學者應(yīng)加強研究，將測定的序列及時提交，一方面可供科學家們共享信息，另一方面可更準確和客觀地評價ITS2分子標志的價值。

通過分析已注冊的ITS2序列，提示其在中國按蚊亞屬蚊種間具有良好的解析度，但也發(fā)現(xiàn)在部分種內(nèi)存在一定程度的變異性(通常小于1%)。種內(nèi)差異性存在的原因應(yīng)是該種的進化快速且活躍，近期或正在隱種分化，如：中華按蚊種內(nèi)差異性小于1%，已發(fā)現(xiàn)的野外中華按蚊與克萊按蚊的雜交種的事實，即是克萊按蚊從中華按蚊正在分化的印證和足跡。

筆者整理和分析GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列時，發(fā)現(xiàn)因注冊者不同導(dǎo)致的種內(nèi)序列差異屢見不鮮，有時難以判斷其可靠性，故筆者以為出現(xiàn)上述情形時，應(yīng)綜合其他信息判斷，如樣本來源、鑒定者、注冊者和序列是否發(fā)表等。