童群波 陸紹紅

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所，杭州 310013)

寄生蟲病的危害仍是普遍存在的公共衛(wèi)生問題，在發(fā)展中國家，特別在熱帶和亞熱帶地區(qū)，寄生蟲病依然廣泛流行,威脅著無數(shù)兒童和成人的健康甚至生命。聯(lián)合國開發(fā)計劃署/世界銀行/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合倡議的熱帶病特別規(guī)劃要求防治的6類主要熱帶病中，除麻風(fēng)病外，其余5類都是寄生蟲病，即瘧疾(Malaria)、血吸蟲病(Schistosomiasis)、絲蟲病(Filariasis)、利什曼病(Leishmaniasis)和錐蟲病(Trypanosomiasis)。臨床上對寄生蟲病的檢測經(jīng)歷了病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷后，分子生物學(xué)診斷方法也日益發(fā)展，特別是PCR技術(shù)作為一種高效的核酸擴增技術(shù)在寄生蟲病檢測方面發(fā)揮了重大作用，但是PCR操作必須有高精密的熱循環(huán)儀器和凝膠成像儀，使其在基層和現(xiàn)場開展受到嚴重制約。Notomi等(2000)首先提出一種全新的核酸擴增技術(shù)——環(huán)媒恒溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)，它是一種快速、簡單、靈敏、特異的核酸擴增方法,針對靶基因的6個獨立區(qū)域設(shè)計4條特異引物，F(xiàn)IP, BIP, F3 和B3(圖1)，在鏈置換DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下高效擴增靶基因。首先，內(nèi)引物FIP與模板F2c 結(jié)合，在 Bst DNA聚合酶的作用下啟動鏈DNA合成，外引物F3與模板F3c 結(jié)合并合成與模板DNA互補的單鏈，同時置換出FIP引物合成的DNA鏈。BIP與置換鏈DNA雜交，開始新鏈的合成。然后B3引導(dǎo)合成FIP引物合成鏈的互補鏈，置換釋放BIP引物合成鏈，被置換的單鏈DNA均存在互補序列，發(fā)生自我堿基配對，兩端各自形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合，開始新一輪的鏈置換合成，周而復(fù)始，形成高效率的擴增，擴增的最后產(chǎn)物為大量長短不一的DNA鏈。其特點包括：(1) 不需要昂貴的PCR儀等設(shè)備，只需恒溫裝置，如水浴鍋；(2)擴增效率高，在水浴恒溫(60～65℃),反應(yīng)3O～60 min可使低拷貝數(shù)的DNA擴增達109水平；(3)結(jié)果判斷簡單，LAMP技術(shù)在核酸合成過程中，從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)(dNTPs)中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生大量白色焦磷酸鎂沉淀，因此，可以通過渾濁度直接肉眼觀察，或者通過反應(yīng)前加入鈣黃綠素來觀察顏色的變化，也可以通過濁度儀實時監(jiān)測，無需電泳。作為一種新的核酸擴增方法，LAMP被逐漸應(yīng)用于寄生蟲、病毒、微生物的檢測,在疾病的快速檢測方面發(fā)展迅速，是最有發(fā)展前景的快速診斷方法之一，現(xiàn)將LAMP技術(shù)在寄生蟲檢測方面的應(yīng)用綜述如下。

圖1 環(huán)媒恒溫擴增(LAMP)技術(shù)引物設(shè)計Fig.1 Primer design for Loop-mediated isothermal amplication

1 蠕蟲

1.1 吸蟲

1.1.1日本血吸蟲Schistosomajaponicum：楊秋林等(2008)開展了應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測日本血吸蟲尾蚴的實驗研究,設(shè)計4條擴增尾蚴鈣結(jié)合蛋白基因的LAMP引物，進行LAMP反應(yīng)，LAMP可檢測到尾蚴的最低數(shù)量為1條。Xu等(2010)針對日本血吸蟲高度重復(fù)的轉(zhuǎn)座子SjR2基因序列設(shè)計引物，DNA最小檢測量達到 0.08 fg，敏感性是傳統(tǒng)PCR的104，能夠檢測感染血吸蟲尾蚴1周后的兔血清。經(jīng)吡喹酮治療，12周后無法檢測到血清中的日本血吸蟲基因組DNA。Wang等(2011)同樣根據(jù)SjR2設(shè)計引物，LAMP方法能檢測出感染1周后兔血清中的血吸蟲DNA，而傳統(tǒng)的PCR方法需要在感染2周后才能檢測到。分別進行青蒿琥酯和吡喹酮治療后檢測不到血清中的DNA。這些結(jié)果表明LAMP方法對于血吸蟲感染的早期診斷及評價藥物的療效是有效的。Kumagai等(2010)建立了基于28S核糖體(Sj28S)的LAMP方法，設(shè)計的引物特異性良好，與曼氏血吸蟲S.mansoni無交叉反應(yīng)。用PCR和LAMP法平行檢測日本血吸蟲感染的釘螺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP法與PCR法檢測的靈敏度同樣，最低檢測限度為100 fg，能夠檢測出釘螺Oncomelaniahupensis感染1個毛蚴1 d后的血吸蟲DNA。同時群體檢測結(jié)果顯示LAMP能擴增1個感染的釘螺混合100個陰性釘螺的混合樣本中的血吸蟲DNA，因此可應(yīng)用LAMP方法進行現(xiàn)場樣本的群體檢測，從而預(yù)測流行區(qū)的感染風(fēng)險。

1.2 絳蟲

1.2.1細粒棘球絳蟲Echinococcusgranulosus：徐祥珍等(2011)根據(jù)囊型棘球蚴病病原細粒棘球絳蟲線粒體12S rRNA序列的保守區(qū)域，設(shè)計4條LAMP反應(yīng)引物，用LAMP技術(shù)檢測我國較為流行的細粒棘球絳蟲DNA，以家犬體內(nèi)常見的泡狀帶絳蟲TaeniahydatigenaDNA為對照，評價該技術(shù)檢測棘球蚴病的特異性。結(jié)果顯示該引物與泡狀帶絳蟲不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性；同時，對不同稀釋度細粒棘球絳蟲蟲卵進行檢測，發(fā)現(xiàn)能檢測到含1個蟲卵的DNA樣本，提示該法具有較高的敏感性。因此，LAMP技術(shù)有望成為檢測棘球蚴病病原感染的新方法，并可用于終宿主棘球絳蟲感染的常規(guī)監(jiān)測。

1.2.2帶絳蟲Taenia：Nkouawa等(2009)根據(jù)絳蟲組織蛋白酶樣半胱氨酸肽酶(clp)和細胞色素c氧化酶亞基1(Cox1)基因設(shè)計LAMP引物，建立檢測帶絳蟲的LAMP方法。其中根據(jù)Cox1基因建立的LAMP方法可以區(qū)分3個種，而根據(jù)clp基因建立的LAMP可以區(qū)分有鉤絳蟲T.solium和無鉤絳蟲T.saginata或亞洲帶絳蟲T.asiatica，通過限制性酶消化LAMP產(chǎn)物又可區(qū)分無鉤絳蟲和亞洲帶絳蟲。隨后，Nkouawa等(2012)應(yīng)用這個方法鑒別人攜帶的帶絳蟲的亞種。從35個帶蟲者中分離到51個節(jié)片，LAMP鑒定結(jié)果顯示有9個為豬帶絳蟲Taeniasolium，1個為亞洲帶絳蟲T.asiatica，另外41個為牛帶絳蟲T.saginata，結(jié)果顯示LAMP方法能夠用于帶絳蟲的快速鑒別，有助于帶絳蟲病的預(yù)防和控制。

1.3 線蟲

1.3.1廣州管圓線蟲Angiostrongyluscantonensis：Chen等(2011)建立了基于廣州管圓線蟲18s rRNA的LAMP方法，最低能檢測到1 fg的基因組DNA，比PCR方法敏感。另外還進行了交叉反應(yīng)性研究，此方法與剛地弓形蟲Toxoplasmagondii、惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum、日本血吸蟲S.japonicum華支睪吸蟲Clonorchissinensis、衛(wèi)氏肺吸蟲Paragonimuswestermani和異尖線蟲Anisakis均無交叉反應(yīng)。用此LAMP方法檢測人工感染廣州管圓線蟲35 d后的福壽螺Pomaceacanaliculatasnails，均為陽性，說明對于福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的檢測是有效的。Liu等(2011)建立了一種特異性的LAMP方法檢測褐云瑪瑙螺Achatinafulica內(nèi)廣州管圓線蟲DNA，引物基于rDNA的第一轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(The first internal transcribed spacer，ITS-1)，與簡單異尖線蟲Anisakissimplexs.s, 毛首扁形線蟲Trichuristrichiura，犬弓蛔蟲Toxocaracanis，旋毛蟲Trichinellaspiralis及人蛔蟲Ascarislumbricoides均無交叉反應(yīng)，比傳統(tǒng)的PCR方法相敏感10倍，最低檢出DNA達到0.01 ng/μL。為了評價此方法的應(yīng)用價值，從流行區(qū)收集檢測了45個褐云瑪瑙螺，PCR方法檢出率為46.7%(21/45)，而LAMP方法為51.1%(23/45)，提示LAMP方法比傳統(tǒng)PCR方法更敏感。

1.3.2異尖線蟲Anisakis：鄭洋妹等(2010)根據(jù)簡單異尖線蟲Anisakissimplexs.sITS保守區(qū)域序列設(shè)計特異性引物，建立了快速鑒定該蟲的LAMP方法。對10倍比稀釋的簡單異尖線蟲ITS序列重組質(zhì)粒進行靈敏性試驗,靈敏度達到10拷貝/μL；用典型異尖線蟲Anisakistypica、對盲囊線蟲Contracaecumsp.、針蛔線蟲Raphidascaristrichiuri作為對照進行特異性試驗，無交叉反應(yīng)；應(yīng)用建立的LAMP方法檢測7份經(jīng)PCR—RFLP鑒定為簡單異尖線蟲的樣品，結(jié)果均為陽性，顯示建立的LAMP方法靈敏性高、特異性強，是檢測簡單異尖線蟲的有效手段。

2 原蟲

2.1 瘧原蟲Plasmodium

瘧疾是世界上危害最嚴重的寄生蟲病之一，人體瘧原蟲主要有惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum、間日瘧原蟲P.vivax、三日瘧原蟲P.malariae和卵形瘧原蟲P.ovale4種。近年來建立了以18S rRNA為檢測靶標的可鑒別這四種瘧原蟲的LAMP方法(Poonetal., 2006; Hanetal., 2007; Parisetal., 2007; Yamamuraetal., 2009)。Han等(2007)根據(jù)人瘧原蟲18S rRNA建立LAMP方法，對4種瘧原蟲進行了臨床診斷，并與顯微鏡檢和巢式PCR進行對比。結(jié)果表明，對于三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲，LAMP檢測18S rDNA的最低檢出限為1O個拷貝。而對于惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲檢出限為100個拷貝。其檢出準確性與巢式PCR完全相符，但相比巢式PCR耗時更短，不需要復(fù)雜的過程，只需熱處理過的血樣即可作為模板，4種瘧原蟲均可在40 min內(nèi)完成LAMP檢測。LAMP實驗簡單可靠，既可用于瘧疾流行區(qū)監(jiān)測，也可用于實驗室診斷。Sirichaisinthop等(2011)把上述LAMP方法應(yīng)用于現(xiàn)場診斷，同時與鏡檢方法比較。110份血液樣品中60份鏡檢陽性的樣品檢出59份為陽性(敏感性98.3%)，50份鏡檢陰性的樣品全部為陰性(特異性100%)。LAMP的陰性預(yù)測值和陽性預(yù)測值分別為98%和100%，表明LAMP方法是現(xiàn)場診斷瘧疾的有效工具。Lu等(2012)用LAMP方法、巢式PCR和鏡檢方法診斷間日瘧。164例采自我國中部瘧疾流行區(qū)的鏡檢陽性樣本中，LAMP方法檢出160例間日瘧原蟲，敏感性為97.6%，而巢式PCR檢出162例，敏感性為98.8%，LAMP方法簡便易行，表明LAMP方法在瘧疾流行區(qū)診斷間日瘧是可行的。陳勤等(2011)利用此LAMP方法對采自云南、海南省的惡性瘧患者血樣進行瘧原蟲檢測，并與鏡檢和巢式PCR結(jié)果作比較，評估其檢測疫區(qū)惡性瘧患者血中瘧原蟲的特異性和敏感性。共檢測78份惡性瘧患者和3O份健康人血樣，其中72份患者血樣LAMP檢測為陽性，以鏡檢法為金標準，LAMP篩檢的靈敏度為92.3%、特異性為100%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100%和83.3%；以巢式PCR為參考，LAMP篩檢的靈敏度為97.2%，特異性為94.4%，顯示LAMP方法檢測惡性瘧原蟲的敏感度和特異性與巢式PCR方法相近，可應(yīng)用于現(xiàn)場惡性瘧原蟲的檢測。

2.2 弓形蟲Toxoplasma gondii

Kong等(2012)根據(jù)529 bp重復(fù)序列設(shè)計引物，建立了一種新的LAMP方法，反應(yīng)在65℃下進行1 h，弓形蟲基因組DNA的最低檢測量為0.6 fg，比基于B1基因的LAMP和基于 529 bp重復(fù)序列的巢式PCR檢出敏感性分別高100和1 000倍，而且與伊氏錐蟲Trypanosomaevansi、惡性瘧原蟲P.falciparum、日本血吸蟲S.japonicum、衛(wèi)氏并殖吸蟲Paragonimuswestermani、肝片吸蟲Fasciolahepatica和廣州管圓線蟲A.cantonensis的DNA無交叉反應(yīng)性。用此LAMP方法能檢測感染剛地弓形蟲RH株速殖子1 d后的小鼠血樣,首次報道了LAMP能用于實驗室感染小鼠的弓形蟲早期診斷。陳道楨等(2011)選用構(gòu)建的弓形蟲Bl基因質(zhì)粒為陽性模板，建立LAMP檢測弓形蟲的方法，并進行特異性和敏感性評估，在此基礎(chǔ)上建立LAMP檢測弓形蟲的定量體系及通過顯色反應(yīng)直接判斷結(jié)果的簡便方法，最后應(yīng)用建立的方法對57例孕婦外周血標本進行了檢測，因此有望在臨床檢測中發(fā)揮一定的作用。Krasteva等(2009)選取剛地弓形蟲的SAG1基因設(shè)計引物，LAMP實驗與傳統(tǒng)PCR的實驗結(jié)果相符。

2.3 錐蟲Trypanosoma

I型布氏岡比亞錐蟲Trypanosomabruceigambiense是引起非洲錐蟲病(Human African trypanosomiasis，HAT)的主要致病原，岡比亞HAT精確診斷始終缺乏有效的方法，Njiru等(2008)根據(jù)涎傳錐蟲亞屬的重復(fù)插入活動因子(Repetitive insertion mobile element, RIME)建立了LAMP方法，只需25 min即可做出鑒定。Njiru等(2011)采用岡比亞錐蟲特異的糖蛋白基因 (TgsGP)為模板，敏感性相當(dāng)于能檢測10 個錐蟲/mL提取DNA或煮沸血液上清中1個錐蟲/mL，而傳統(tǒng)PCR的敏感性大約在10～1 000個錐蟲/mL。

2.4 隱孢子蟲Cryptosporidium

隱孢子蟲是一種危害嚴重的人獸共患、機會致病性病原，它們感染免疫功能正常的宿主后并不引起嚴重臨床癥狀，當(dāng)機體抵抗能力下降或免疫功能不全時，其繁殖能力和致病能力增強，患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和體征，甚至危及生命。Bakheit等(2008)從南非的牛、綿羊和馬的糞便中提取隱孢子蟲DNA，根據(jù)隱孢子蟲18S rRNA序列，用巢式PCR方法檢測全部為陰性，而用LAMP方法檢測有1/3以上的樣本為陽性。研究表明LAMP技術(shù)比巢式PCR更敏感。袁忠英等(2009)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測牛糞中提取的隱孢子蟲卵囊DNA，根據(jù)隱孢子蟲18S rRNA序列設(shè)計4對隱孢子蟲特異引物，利用LAMP檢測牛糞中隱孢子蟲卵囊DNA和藍氏賈第鞭毛蟲GiardialambliaDNA，以正常牛糞DNA為陰性對照。結(jié)果隱孢子蟲卵囊DNA為陽性，藍氏賈第鞭毛蟲DNA為陰性，具有良好的特異性。

2.5 藍氏賈第鞭毛蟲Giardia lamblia

藍氏賈第鞭毛蟲是一種重要的人獸共患寄生原蟲，分布于全世界，由該寄生蟲感染引發(fā)的腹瀉可在人和動物之間通過水源、食物等途徑廣泛傳播，引起暴發(fā)流行。Plutzer等(2009)利用LAMP技術(shù)對35份樣品進行檢測，其中陽性24份，常規(guī)PCR檢測23份陽性；利用LAMP法成功地擴增了0.548 pg賈第鞭毛蟲集聚體B的DNA和0.8 pg賈第鞭毛蟲集聚體A的DNA；特異性實驗顯示LAMP法只能擴增賈第鞭毛蟲集聚體A和B，其他寄生蟲均不能擴增。盧維媛等(2010)利用體外培養(yǎng)藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體，提取DNA，建立LAMP技術(shù)檢測藍氏賈第鞭毛蟲的方法, 結(jié)果顯示藍氏賈第鞭毛蟲為陽性，與安氏隱孢子蟲DNA、惡性瘧原蟲DNA無交叉反應(yīng)性。

2.6 巴貝西蟲 Babesia

巴貝西蟲是一類血液寄生型原生動物，經(jīng)蜱傳播，主要侵染犬、牛、馬類等脊椎動物，患病動物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、黃疸、貧血等癥，近年來，在人類中也發(fā)現(xiàn)巴貝西蟲病的存在。Guan等(2008)設(shè)計了2對分別針對巴貝西臨潭株Babesiasp.BQ1(Lintan)和巴貝西新疆株Babesiasp. Xinjiang 18S rRNA的LAMP引物，用來檢測感染的羊血和純化的巴貝西蟲提取的DNA。對于巴貝西臨潭株和巴貝西新疆株的最小檢測量分別為0.02 pg和0.2 pg。 365份從甘肅采集的感染巴貝西蟲的綿羊血，其中14.3%(52/365)LAMP檢測為陽性。145份從新疆放牧的綿羊采集的樣品中，3.5%(5/145)LAMP檢測為陽性，結(jié)果表明LAMP方法能作為巴貝西蟲感染的新的檢測方法。Liu等(2012)設(shè)計了2對分別針對牛巴貝西蟲B.bovis和雙芽巴貝西蟲B.bigemina轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)的引物，最小檢測量都達到0.1 pg，優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR方法。這個方法已經(jīng)在實驗室感染的牛血樣本和現(xiàn)場的牛血樣本進行了驗證評估。因此對于巴貝西蟲流行的國家，LAMP方法在流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷方面有潛在的應(yīng)用價值。

3 結(jié)語

作為一種新的核酸擴增方法，LAMP已被逐漸應(yīng)用于病原的分子檢測。LAMP技術(shù)在實際應(yīng)用中還存在一些問題：(1)篩選特異性靶標和設(shè)計引物是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵，有些疾病的靶基因無法設(shè)計合適的引物，可能不適合LAMP方法；(2)LAMP方法的擴增效率很高，在反應(yīng)過程中有大量的核酸合成，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內(nèi)大多數(shù)實驗室不能嚴格分區(qū)，容易導(dǎo)致污染和出現(xiàn)反應(yīng)假陽性；(3)LAMP試劑相對于PCR試劑價格較貴。相信在未來的研究中LAMP將得到更多的改進和完善，在寄生蟲病的快速分子檢測中發(fā)揮更大的作用。