聞 靜 趙 剛 焦 丹 王建華 王曉丹 王國(guó)政 時(shí)曉杰**

(1．黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江黑河 164300；2. 黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局漠河辦事處，黑龍江漠河 165300)

蜱是攜帶及傳播病原體較多的一種媒介生物，其攜帶的病原體大多數(shù)都可引起自然疫源性疾病和人獸共患病，如森林腦炎、萊姆病、立克次體病、土拉菌病等(高志華和劉敬澤, 2003)。近年來(lái)，一些新發(fā)或再度肆虐的蜱媒疾病對(duì)人畜的危害日趨嚴(yán)重，如嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體病、人巴貝西原蟲(chóng)病、新立克次體病等在局部地區(qū)流行(Sunetal.，2008；宋鋒林等，2011)，引起了公共衛(wèi)生部門(mén)的高度重視，黑河地區(qū)與俄羅斯接壤，是我國(guó)對(duì)俄羅斯貿(mào)易的重要口岸，也是一些蜱媒疾病如萊姆病(付維明等，2009)、立克次體病(孫秀峰等，2007)等蜱傳疾病的疫區(qū)之一。加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)的衛(wèi)生監(jiān)督、有效的診斷及溯源蜱傳疾病對(duì)該區(qū)域的影響是預(yù)防國(guó)境口岸重要傳染病發(fā)生及生物恐怖事件的基礎(chǔ)。為此，本文于中俄邊境黑河口岸地區(qū)采集蜱類(lèi)，并開(kāi)展蜱傳病原體監(jiān)測(cè)研究，為明確該地區(qū)的蜱媒病原本底，提升口岸檢驗(yàn)檢疫能力奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蜱類(lèi)采集：2012年4月16日至10月8日期間每個(gè)月分別在上旬及下旬進(jìn)行兩次蜱蟲(chóng)采集，采用布旗法在黑河、遜克、孫吳及漠河地區(qū)(表1)進(jìn)行蜱蟲(chóng)采集，采集到731只蜱(森林革蜱Dermacentorsilvarum686只、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna36只、全溝硬蜱Ixodespersulcatus9只)分成95組(除漠河的森林革蜱每組10只，全溝硬蜱每組9只其余均每組7～8只)進(jìn)行病原體檢測(cè)。

表1 蜱的采集地點(diǎn)及生境描述Tab.1 The description of the sample sites and habitat

1.1.2試劑：Taq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒及基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自Promega公司，大腸桿菌DH5α、dNTPs、DL2000 DNA marker、T載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1基因組提取：基因組DNA及總RNA的提取在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，每只蜱用75%酒精浸泡3～5 min，用無(wú)菌的雙蒸水沖洗3次，7～8只一組分裝在EP管內(nèi)，利用組織破碎儀50/s振動(dòng)破碎3 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA及RNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增檢測(cè)：以提取的DNA為模板，按照表2列出的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于檢測(cè)伯氏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、立克次體(屬)、土拉菌、巴貝西蟲(chóng)、查菲埃里克體。擴(kuò)增反應(yīng)體系包括Taq 酶1.25 U，10 ×PCR buffer 5 μL，dNTPs mixture 0.2 μmol/L，上下游引物0.5 μmol/L，模板DNA 約為0.5 μg，補(bǔ)充無(wú)菌水使總體積達(dá)到25 μL。94℃預(yù)變性5 min，然后按照表1列出擴(kuò)增條件PCR循環(huán)，最后72℃延伸5 min。每檢測(cè)組設(shè)一例陰性對(duì)照，反應(yīng)體系同上，以DEPC處理過(guò)的水代替DNA模板。擴(kuò)增到的片段經(jīng)過(guò)膠回收后與 pMD-18T載體連接后送北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。每組陽(yáng)性率按照最小概率計(jì)算即一組陽(yáng)性按照一只蜱攜帶病原體計(jì)算。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物及反應(yīng)條件Tab.2 Experiments primer and reaction condition

TBEVr，TBEVf：森林腦炎病毒Tick borne encephalitis virus；CF1，CR2：伯氏疏螺旋體Borreliaburgdoferi；套式引物OUT-1 OUT-2， IN-1 IN-2: 嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體Anaplasmaphagocytophilum；PIRO-A, PIRO-B:巴貝西蟲(chóng)Babesia；Rsfg877, Rsfg1258:立克次體屬Rickettsia；HME-1F, HME-3R: 查菲埃立克體Ehrlichiaechaffeensis；FtC1, FtC4: 土拉菌F．tularensis.

1.2.3RT-PCR檢測(cè)：以提取的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照Promega反轉(zhuǎn)錄體系，加入1 μL RNA、dNTPs 0.4 μmol/L、1.25 U的RNase抑制劑、0.5 μg的random primer、1.5 U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，加入適量的水至20 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為室溫放置10 min，42℃保溫1 h，之后95℃10 min后結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)體系稀釋至100 μL。取稀釋后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行PCR，用于檢測(cè)森林腦炎病毒，每檢測(cè)組設(shè)一例陰性對(duì)照，反應(yīng)體系同PCR體系，以DEPC處理過(guò)的水代替DNA模板。按照表1列出的引物和擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同上。

2 結(jié)果

2.1 蜱類(lèi)采集結(jié)果

本次采集共獲得蜱類(lèi)標(biāo)本731只，經(jīng)鑒定分屬3屬3種，其中森林革蜱D.silvarum686只占總體構(gòu)成93.84%、全溝硬蜱I.persulcatus9只占總體構(gòu)成1.23%、嗜群血蜱H.concinna36只占總體構(gòu)成4.92%，具體數(shù)據(jù)及分布情況見(jiàn)表2及表3。

表3 蜱的種類(lèi)及病原體檢測(cè)情況Tab.3 Tick sampled and tick borne pathogen detected in Heihe area

2.2 蜱媒病原檢測(cè)情況

采用8對(duì)引物對(duì)采集到的731只蜱分成95組進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率按最小概率即每組一只陽(yáng)性計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在黑河市采集的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)立克次體感染71例，最小陽(yáng)性率為9.58%，隨機(jī)抽取7個(gè)立克次體陽(yáng)性樣品，PCR擴(kuò)增后目的條帶經(jīng)測(cè)序后與NCBI上的同源基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與斑點(diǎn)群熱群立克次體(Spotted fever group rickettsiae，SFGR)的勞氏立克次體Rickettsiaraoultii病原體相似率最高，初步認(rèn)定為斑點(diǎn)熱群立克次體(GenBank登錄號(hào): KC566999)。 Mediannikov等(2008)在與黑河毗鄰的俄羅斯的哈巴羅夫斯克市的森林革蜱中檢測(cè)出這種立克次體的菌株。森林腦炎病毒、伯氏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、查菲埃立克體、巴貝西蟲(chóng)及土拉菌病的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，具體的采集地點(diǎn)及生境描述見(jiàn)表1，采集蜱類(lèi)及病原體檢測(cè)情況見(jiàn)表3。

圖1 立克次體(屬)陽(yáng)性樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection for R. raoultii in D. silvarumM: DL2000marker; 1：陰性對(duì)照；2～7: 立克次體陽(yáng)性樣品. M: DL2000marker; 1：Negative control；2-7: Positive samples.

3 討論

GPS及生境分析如表2所示，本文中大多數(shù)蜱來(lái)自黑河市黑呼公路7公路處，捕獲的蜱類(lèi)主要以森林革蜱為主，森林革蜱與嗜群血蜱的比例約為24∶1，生境主要以小灌木林草地為主的牧區(qū)；遜克縣及孫吳縣捕獲的蜱種較單一分別是森林革蜱和嗜群血蜱，未發(fā)現(xiàn)其他蜱種；漠河縣捕獲的蜱數(shù)量較少但是全溝硬蜱的比例較高，全溝硬蜱與森林革蜱的比率幾乎為1∶1。首先從數(shù)量上看，牧區(qū)及有田間作業(yè)的區(qū)域蜱類(lèi)的數(shù)量較為繁盛，這與蜱類(lèi)的生活習(xí)性息息相關(guān)；再次從蜱種構(gòu)成上分析，緯度高的地區(qū)全溝硬蜱的數(shù)量更具優(yōu)勢(shì)，造成這種蜱種差異的原因較多，有可能與緯度及氣候有關(guān)，也可能與當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境質(zhì)量相關(guān)；從立克次體的感染率上看，只有黑河市存在著立克次體感染的情況，其他地區(qū)均未檢出，但不排除其他地區(qū)存在著蜱傳疾病病原體感染的情況，病原體的檢出率與檢測(cè)樣本數(shù)量的大小有密切關(guān)系，由于除黑河市以外其他地區(qū)采集到蜱類(lèi)數(shù)量較少，可能影響了整體檢出率。

立克次體是一類(lèi)嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞微生物，在自然界的許多脊椎動(dòng)物中廣泛分布，蜱類(lèi)是其重要的傳播媒介。在我國(guó)，從北向南，從東到西，以及中原地帶，都存在斑點(diǎn)熱群立克次體的感染。黑龍江是斑點(diǎn)熱群立克次體的主要疫區(qū)(劉國(guó)平等，2008)，孫秀峰等(2007)曾對(duì)黑龍江中俄口岸的立克次體情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大部分感染樣品屬北亞蜱傳傷寒立克次體R.sibirica感染，只有少數(shù)為R.heilongjiangensis和R.hulinii感染。Rickettsiaraoultii曾在歐洲的邊緣革蜱D.marginatus中發(fā)現(xiàn)，本文發(fā)現(xiàn)R.raoultii在森林革蜱中的存在，這和我國(guó)西藏地區(qū)報(bào)道的西藏革蜱D.everestianus和銀盾革蜱D.niveus(現(xiàn)更名為塔吉克斯坦革蜱D.daghestanicus)中發(fā)現(xiàn)的R.raoultii具有一定的相似性(Wangetal., 2012)，但由于自然地理?xiàng)l件和海拔的差異，R.raoultii的致病性和傳播特征是否存在差異有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)中國(guó)與俄羅斯邊境黑河口岸地區(qū)2012年采集到的731只蜱攜帶的病原體進(jìn)行檢測(cè)。從蜱種構(gòu)成來(lái)看，森林革蜱是黑河地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種占總體構(gòu)成的93.8%，其次是嗜群血蜱，再次是全溝硬蜱。楊麗煒等(2009)曾經(jīng)對(duì)黑龍江口岸蜱類(lèi)攜帶病原體進(jìn)行了調(diào)查，其中黑河口岸蜱類(lèi)埃立克體感染率為4.48%，萊姆病的感染率為2.25%及斑點(diǎn)熱立克次體感染率為0.90%；國(guó)內(nèi)學(xué)者曾從中俄口岸地區(qū)的全溝硬蜱中分離出了巴貝西蟲(chóng)病原體證明了我國(guó)中俄邊境地區(qū)蜱中存在微小巴貝西原蟲(chóng)的自然感染源(Sunetal.，2008；付維明，2010)。在本調(diào)查中并未發(fā)現(xiàn)有萊姆病、巴貝西蟲(chóng)及埃立克體病原體，這種調(diào)查結(jié)果的差異可能與地區(qū)蜱種構(gòu)成密切相關(guān)，付維明等(2009)在對(duì)中俄口岸各蜱種調(diào)查發(fā)現(xiàn)全溝硬蜱的帶菌率均較高，達(dá)到21.7%，森林革蜱和嗜群血蜱的帶菌率較低，平均為2.4%和3.3%。本實(shí)驗(yàn)中全溝硬蜱只占1.23%，攜帶病原體較低的蜱種森林革蜱數(shù)量占93.84%。何浩等(2008)對(duì)黑河地區(qū)蜱傳疾病調(diào)查時(shí)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)萊姆病螺旋體、巴貝西蟲(chóng)及埃立克體陽(yáng)性樣本，與本研究結(jié)果一致，除萊姆病、埃立克體、立克次體及巴貝西蟲(chóng)外，黑河口岸還未有發(fā)現(xiàn)其他蜱媒病原體的報(bào)道。