曾 雯 左 麗 尹 科 張海燕

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽(yáng)550004)

登革病毒(Dengue virus，DEN)主要由埃及伊蚊及白紋伊蚊傳播，其感染已成為全球性重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中以登革2型病毒(Dengue virus type 2，DEN2)感染最為常見(jiàn)和嚴(yán)重［1］。目前認(rèn)為登革病毒的致病機(jī)制主要與機(jī)體的免疫功能和病毒毒力有關(guān)，由此提出的發(fā)病機(jī)制包括抗體依賴(lài)的增強(qiáng)作用、細(xì)胞免疫和細(xì)胞因子的作用等，但仍未完全闡明。DEN為被覆包膜的單股、正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約11 kb，可編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、M、E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。其中NS5蛋白是病毒基因組編碼的最大的蛋白，分子量104×103。近年來(lái)的研究表明，NS5蛋白具有RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRP)功能，即可以識(shí)別具有相對(duì)特異性的模板RNA并與之結(jié)合，合成與模板互補(bǔ)的RNA鏈，在病毒基因組復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用，NS5可以成為阻斷或抑制病毒復(fù)制的靶標(biāo)。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)具有強(qiáng)大的捕獲、加工、遞呈抗原的能力，在對(duì)病原微生物的監(jiān)測(cè)與應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，通過(guò)表達(dá)的Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)胞外區(qū)參與病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的識(shí)別［2］，誘導(dǎo)初始 T 細(xì)胞活化和增殖，胞內(nèi)段的髓樣分化因子88(Myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88)作為重要的轉(zhuǎn)接蛋白參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，在固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用［3，4］，因此認(rèn)為T(mén)LR是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁［5］。不同的TLR利用不同或相同的接頭蛋白向下轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，其中與病毒識(shí)別相關(guān)的TLRs(TLR3、TLR7/8、TLR9)，只有TLR3介導(dǎo)的是TRIF依賴(lài)型信號(hào)通路，而TLR7/8、TLR9介導(dǎo)的是MyD88依賴(lài)型信號(hào)通路。TLR與相應(yīng)配體結(jié)合后在MyD88依賴(lài)方式中會(huì)產(chǎn)生核內(nèi)因子κB(Nucleus factor kappa B，NF-κB)依賴(lài)細(xì)胞因子，IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(Gamma interferon inducible protein 10，IP-10)可誘導(dǎo)IL-12的聚集而使Th0向Th1方向極化［6］，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)作用。此外，還可產(chǎn)生IFN-α直接干擾病毒的復(fù)制，或活化NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞從而在抗病毒感染中發(fā)揮作用。

本研究利用DEN2感染小鼠BMDC后，通過(guò)檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞中TLR7、MyD88、NF-κB的表達(dá)變化，觀察IFN-α、IP-10的分泌動(dòng)態(tài)，探討 DEN對(duì) TLR7-MyD88依賴(lài)型信號(hào)通路的影響，及其該信號(hào)通路介導(dǎo)IFN-α、IP-10的分泌對(duì)被感染 BMDC內(nèi) DEN2 NS5核酸水平的影響，以期探討MyD88依賴(lài)型信號(hào)通路在DEN2感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒株 6～8周齡C57BL/6小鼠，雌雄隨機(jī)，體重(16±2)g，購(gòu)于重慶騰鑫比爾有限公司，許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0003編號(hào):000031。登革2型病毒NGC株(DEN2 NGC株):購(gòu)于中國(guó)預(yù)防科學(xué)院流行病研究所，本室常規(guī)液氮保存。

1.2 主要試劑 重組小鼠白細(xì)胞介素4(rmIL-4)、重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGMCSF)均購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司。RPMI1640培養(yǎng)基、H-DMEM培養(yǎng)液、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。流式抗體 Hamster Anti-mouse CD11c APC(IgG1)、Rat Anti-mouse I-A/I-E FITC(IgG2a)、Rat Anti-mouse CD86 PE(IgG2a)均購(gòu)自美國(guó)BD公司。Western blot抗體 Rabbit polyclonal anti-TLR7、Rabbit polyclonal anti-MyD88、Rabbit polyclonal anti-NF-κB p65、Rabbit polyclonal anti-GAPDH均購(gòu)自美國(guó) Abcam公司。TRIzol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。IP-10、IFN-α ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。DEN2 NS5基因區(qū)(上游5'-ACAAGTCGAACAACCTGGTCCAT-3'，下游 5'-GCCGCACCATTGGTCTTCTC-3')及 GAPDH(上游 5'-CATCACTGCCACCCAGAAGA-3'，下游5'-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3')引物由上海捷瑞生物有限公司合成。FITC標(biāo)記兔抗DEN2 E蛋白抗體購(gòu)自上海億欣公司。

1.3 方法

1.3.1 C57BL/6小鼠 BMDC的制備 6～8周齡C57BL/6小鼠，雌雄隨機(jī)，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒，無(wú)菌取股骨、脛骨，注射器沖出骨髓細(xì)胞，1 000 r/min，5分鐘，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液室溫作用2～3分鐘，D-Hanks洗滌2次，用含10%胎牛血清、100 U 雙抗、10 ng/ml rmGM-CSF、1 ng/ml rmIL-4的RPMI1640培養(yǎng)液配成1×106ml－1細(xì)胞懸液，2 ml/孔接種于12孔板，37℃ 5%CO2培養(yǎng)2～3天，棄非貼壁細(xì)胞，全量換液后繼續(xù)培養(yǎng)［7］，培養(yǎng)5天收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其純度及成熟情況。

1.3.2 DEN2 吸附鼠源性 BMDC 10－5.8TCID50 的DEN2 100 μl感染1.1 ×106個(gè) C57BL/6 小鼠髓源性DC，感染MOI=0.4，37℃孵育4 小時(shí)，D-Hanks洗滌2次，補(bǔ)充含10%胎牛血清、100 U雙抗、10 ng/ml rmGM-CSF，1 ng/ml rmIL-4的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí);取DEN2感染組及正常組BMDC，37℃甲醛熏蒸30分鐘固定于載玻片上，PBS洗滌3次，10 μl兔血清封閉30分鐘，PBS洗滌同前，滴加FITC標(biāo)記抗DEN2抗體(1∶100稀釋;含0.02%伊文斯藍(lán))，37℃避光 1小時(shí)，PBS洗滌3～5次，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3 Western blot動(dòng)態(tài)檢測(cè) DEN2感染鼠源性BMDC 后 TLR7、MyD88、NF-κB、GAPDH 蛋白的變化DEN2(MOI=0.4)感染鼠源性 BMDC，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照，于感染后24、48、72小時(shí)收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總蛋白，Western blot動(dòng)態(tài)檢測(cè)感染組及正常對(duì)照組 TLR7、MyD88、NF-κB、GAPDH 蛋白的變化。利用BCA法進(jìn)行蛋白定量，分別取各組不同時(shí)間點(diǎn)100 μg蛋白上樣;SDS-PAGE分離總蛋白，0.8 mA/cm2膜面積恒流半干轉(zhuǎn)膜1小時(shí)，5%脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí)，PBST洗膜3次，5～10分鐘/次;一抗 4℃ 孵育過(guò)夜;(TLR7、MyD88、NF-κB 稀釋比例為 1∶1 000、GAPDH 稀釋比例為1∶3 000)。次日，PBST充分洗膜，加入標(biāo)記 HRP的羊抗兔 IgG(1∶1 000稀釋)，常溫孵育1～2小時(shí)，PBST洗膜4次，5～10分鐘/次，ECL孵育5分鐘后曝光顯影。Quantity one軟件分析蛋白曝光條帶灰度值，與同組GAPDH灰度相比得到相對(duì)灰度比值，以24小時(shí)正常對(duì)照組蛋白表達(dá)為參照，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.4 ELISA檢測(cè)鼠源性 BMDC培養(yǎng)上清 IFN-α、IP-10的水平 DEN2(MOI=0.4)感染鼠源性BMDC，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照，于感染后24、48、72小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，雙抗體夾心ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)感染組及正常對(duì)照組IFN-α、IP-10的水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體操作如下:96孔酶標(biāo)板分設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔，各孔均設(shè)復(fù)孔。(1)Wash buffer潤(rùn)濕酶標(biāo)板，分別加標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、待測(cè)樣本50 μl/孔，并在各孔中加入生物素化抗小鼠IFN-α/IP-10 50 μl，18 ～25℃孵育2 小時(shí)，Wash buffer洗板4次，甩干;(2)加HRP標(biāo)記的親和素100 μl/孔，18～25℃孵育1小時(shí)，洗板同前;(3)底物工作液(TMB)100 μl/孔，18～25℃避光孵育30分鐘，加終止液100 μl/孔，酶標(biāo)儀在測(cè)量波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)630 nm，讀取各孔吸光值及濃度。為排除細(xì)胞數(shù)目對(duì)上清中待檢蛋白含量的影響，按每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)校正所得數(shù)據(jù)。

1.3.5 RT-PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)鼠源性 BMDC中 DEN2載量 TRIzol法提取DEN2感染組及對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)BMDC總RNA，按Invitrogen M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，定量逆轉(zhuǎn)錄5 μg cDNA，利用500 ng cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH及DEN2 NS5核酸，反應(yīng)體系為 50 μl，依次加入 dddH2O 34.3 μl，cDNA 5.0 μl，10 × PCR buffer 5.0 μl，dNTP 1.0 μl，MgCl21.5 μl，上游引物(10 μmol/L)1.5 μl，下游引物(10 μmol/L)1.5 μl，ExTaq 0.2 μl。PCR 擴(kuò)增條件:94℃ 4分鐘;94℃ 30秒;64℃ 45秒;72℃ 1分鐘;72℃ 7分鐘進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，1%瓊脂糖凝膠電泳分析5 μl PCR產(chǎn)物。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用±s表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠 BMDC的獲得 rmGM-CSF、rmIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)C57BL/6小鼠骨髓前體細(xì)胞，培養(yǎng)至第5天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其純度及成熟情況;CD11c為小鼠BMDC的特異性標(biāo)志，其表達(dá)情況可反映小鼠BMDC純度;CD86、I-A/I-E等共刺激信號(hào)分子是DC成熟的重要標(biāo)志，LPS可刺激DC成熟，高表達(dá)CD86、I-A/I-E等共刺激分子。誘導(dǎo)得到的BMDC經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)純度達(dá)70%(圖1);且未成熟情況與LPS刺激組相比具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定C57BL/6小鼠BMDC的純度及成熟情況Fig.1 The purification and maturity of bone marrow dendritic cells from C57BL/6 was identificated by Flow cytometry

2.2 DEN2吸附鼠源性BMDC情況 DEN2(MOI=0.4)感染鼠源性BMDC 24小時(shí)后，通過(guò)直接免疫熒光檢測(cè)DEN2吸附BMDC的情況，暗場(chǎng)中觀察到正常對(duì)照組細(xì)胞膜被伊文斯蘭襯染為紅色(圖2A、B);DEN2感染組，暗場(chǎng)中可觀察到FITC標(biāo)記的抗DEN2 E蛋白抗體可與被感染BMDC上的DEN2抗原相結(jié)合(圖2C、D)。

2.3 DEN2 對(duì)鼠源性 BMDC 中 TLR7、MyD88、NF-κB表達(dá)的影響 采用Western blot動(dòng)態(tài)檢測(cè)DEN2感染組及正常對(duì)照組 TLR7、MyD88、NF-κB、GAPDH的表達(dá)(圖3);通過(guò)對(duì)不同時(shí)間目的蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描，24小時(shí)正常對(duì)照組蛋白表達(dá)為參照，半定量分析各蛋白表達(dá)。觀察到病毒感染組TLR7蛋白的表達(dá)24小時(shí)高于正常對(duì)照組，48、72小時(shí)均低于正常對(duì)照組(圖4A);病毒感染組MyD88蛋白的表達(dá)24、48小時(shí)高于正常對(duì)照組，72小時(shí)時(shí)表達(dá)明顯降低，低于72小時(shí)正常對(duì)照組(圖4B);病毒感染組NF-κB蛋白的表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)均高于正常對(duì)照組，在48小時(shí)表達(dá)最高，72小時(shí)有所下降，結(jié)果見(jiàn)圖4C。

表1 樹(shù)突狀細(xì)胞膜表面分子的表達(dá)(±s，n=3)Tab.1 The expression of membrane surface molecules of dendritic cells(±s，n=3)

表1 樹(shù)突狀細(xì)胞膜表面分子的表達(dá)(±s，n=3)Tab.1 The expression of membrane surface molecules of dendritic cells(±s，n=3)

Note:Compare with Non LPS stimulation group，1)P ＜0.05.

Membrane surface molecules The percent of membrance surface molecules(%)Non LPS stimulation LPS stimulation CD11c 71.36 ±3.44 73.29 ±1.25 CD86 29.2 ±4.55 48.82 ±7.221)I-A/I-E 43.55 ±4.01 51.06 ±6.411)

2.4 DEN2促進(jìn)鼠源性BMDC分泌IFN-α、IP-10采用ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)DEN2感染組及正常對(duì)照組BMDC培養(yǎng)上清IFN-α、IP-10的水平，觀察到DEN2感染組IFN-α、IP-10水平均高于正常對(duì)照組，且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DEN2感染組IFN-α隨著時(shí)間延長(zhǎng)分泌量逐漸增加，72小時(shí)分泌量達(dá)(933.94±29.02)ρg/ml也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。DEN2感染組IP-10呈現(xiàn)先升高，48小時(shí)達(dá)高峰，分泌量為(834.44 ±43.60)ρg/ml，72 小時(shí)有所降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.5 C57BL/6小鼠 BMDC中 DEN2動(dòng)態(tài)變化DEN2(MOI=0.4)感染培養(yǎng)5天的C57BL/6小鼠BMDC，24、48、72小時(shí)收集感染組及正常對(duì)照組細(xì)胞，通過(guò) RT-PCR、1%瓊脂糖凝膠電泳分析 DEN2 NS5 PCR產(chǎn)物，觀察到感染組及正常對(duì)照組GAPDH(圖6A)表達(dá)一致，感染組在177 bp處得到特異性DEN2目的條帶，DEN2核酸水平(圖6B)24小時(shí)較高，48小時(shí)達(dá)高峰，72小時(shí)有所減弱。

圖2 DEN2 NGC株吸附BMDC(×200)Fig.2 Characterization of DEN2 NGC strain adhered to BMDC(×200)

圖3 DEN2 NGC株感染BMDC后TLR7、MyD88、NF-κB、GAPDH蛋白表達(dá)Fig.3 The protein expression of TLR7，MyD88，NF-κB，GAPDH in BMDCs infected with DEN2 NGC

圖4 DEN2 對(duì)BMDC TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of DEN2 on expression of TLR7，MyD88，NF-κB in BMDC

圖5 DEN2對(duì)小鼠BMDC分泌IFN-α、IP-10的影響Fig.5 Effects of DEN2 infection on secretion of cytokines(IFN-α，IP-10)in BMDCs

3 討論

圖6 RT-PCR檢測(cè)DC中DEN2 RNAFig.6 Detection of DEN2 RNA in BMDCs by RT-PCR

DC作為目前已知功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中骨髓來(lái)源的DC可識(shí)別多種RNA病毒，包括麻疹病毒、HIV病毒、漢坦病毒、黃病毒及流感病毒［8，9］。分布在 DC上的TLRs可識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，在啟動(dòng)抗細(xì)菌和病毒感染的固有免疫應(yīng)答發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。BMDC被DEN2感染后，主要通過(guò)TLR3、TLR4、TLR7和TLR8識(shí)別及介導(dǎo)抗 DEN免疫反應(yīng)［11］，其中 TLR7及TLR8主要通過(guò)識(shí)別ssRNA介導(dǎo)抗DEN2免疫反應(yīng)，為MyD88依賴(lài)途徑。TLR7廣泛分布于小鼠和人類(lèi)的抗原提呈細(xì)胞(DCs、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞)，此外自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞中也有表達(dá)［12］。靜息狀態(tài)下，TLR7主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是哺乳動(dòng)物單鏈RNA的受體，在受到病原體刺激后，可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白UNC93B1相互作用，并轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)體膜上以識(shí)別相應(yīng)的 PAMPs［13］，在整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，TLR7對(duì)配體的識(shí)別及轉(zhuǎn)錄控制方面起到了非常重要的作用［14］，有研究提示TLR7缺陷的小鼠產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的能力要弱于野生型小鼠，從而不利于病毒的清除，TLR7或MyD88的缺乏將減弱固有免疫并促進(jìn)病毒在組織中的擴(kuò)增［15］。TLR7與相應(yīng)配體結(jié)合后可招募下游接頭蛋白分子啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;MyD88是除TLR3外所有TLR下游信號(hào)所必須的，MyD88通過(guò)產(chǎn)生大量趨化因子使單核巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞聚集發(fā)揮免疫應(yīng)答作用，從而限制病毒的復(fù)制及擴(kuò)散［16］。MyD88依賴(lài)途徑主要活化下游分子NF-κB、p38 MAPK及JNK，使其泛素化后轉(zhuǎn)位入核，可協(xié)同DC增加炎性細(xì)胞因子的分泌，其中NF-κB的活化，可促進(jìn) DC分化成熟及 TNF-α的分泌［17］，在 TLR信號(hào)調(diào)節(jié)中起到積極作用。此外TLR7/MyD88途徑可活化 IRF-3、IRF7引起 IFN-α、IP-10的大量分泌，從而抑制DEN復(fù)制和感染擴(kuò)散。

本研究利用DEN2感染小鼠髓源性DC，動(dòng)態(tài)檢測(cè) TLR7、MyD88、NF-κB 蛋白表達(dá)變化，在病毒感染后24 小時(shí)，TLR7、MyD88、NF-κB 的蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組增高，提示表達(dá)于DC內(nèi)的TLR7識(shí)別單鏈DEN，從而表達(dá)明顯增高，并啟動(dòng)MyD88信號(hào)途徑將識(shí)別信息向下傳遞，最終使NF-κB活化而引起一系列細(xì)胞因子的產(chǎn)生;而隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR7的表達(dá)較24小時(shí)降低，此時(shí)病毒的核酸水平較24小時(shí)增高。有文獻(xiàn)報(bào)道，肝癌細(xì)胞中TLR7 RNA及蛋白的表達(dá)受損及減少是由于丙肝病毒的復(fù)制，用IFN-α預(yù)處理肝癌細(xì)胞以抑制病毒的復(fù)制可使TLR7的表達(dá)不減少，同時(shí)提出雖然丙肝病毒的復(fù)制可使TLR7的表達(dá)減少，但與此同時(shí)，仍上調(diào)其它信號(hào)通路的活化，且活化程度與病毒感染有關(guān)［18］，故考慮TLR7表達(dá)的降低可能是由于病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所致，但其下游MyD88信號(hào)通路已被活化，故MyD88、NF-κB的表達(dá)在感染組均較正常組增高，MyD88、NF-κB表達(dá)增加，可促進(jìn) DC分化成熟，且NF-κB的活化可在病毒感染早期階段介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌，并隨之促進(jìn)Ⅰ型干擾素、趨化因子的分泌而發(fā)揮抗病毒作用。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在DEN2 感染72 小時(shí)后，TLR7、MyD88、NF-κB 的蛋白表達(dá)不論在正常細(xì)胞組還是病毒感染組均較前下降，TLR7介導(dǎo)的信號(hào)通路在病毒感染早期發(fā)揮作用，導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞凋亡，而使病毒感染組TLR7、MyD88、NF-κB的表達(dá)下降，與病毒自身復(fù)制及DEN2感染后產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒作用有關(guān)。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，pDC在識(shí)別病毒后可產(chǎn)生大量的IFN-α。近期研究發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源DC識(shí)別病毒也可產(chǎn)生大量的IFN-α，并具有強(qiáng)大的刺激T細(xì)胞活化的能力［19］。病毒感染DC時(shí)可刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-α/β，啟動(dòng)宿主迅速而強(qiáng)烈的抗病毒應(yīng)答［20］，抑制體外DEN感染擴(kuò)增并誘導(dǎo)產(chǎn)生IP-10，從而抑制病毒對(duì)其它細(xì)胞的感染，引起被感染細(xì)胞的凋亡，最終清除感染的病毒。本研究觀察到，當(dāng)DEN2感染小鼠髓源性DC 24小時(shí)后IFN-α的分泌較正常對(duì)照組升高，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，分泌量不斷增加;DEN2感染72小時(shí)后，IFN-α量達(dá)到最高，而此時(shí)病毒載量卻較48小時(shí)降低，因此可推斷IFN-α在此過(guò)程中發(fā)揮了抗病毒作用。

IP-10是IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10，屬CXCL10趨化因子家族，可招募淋巴細(xì)胞、特異性CTL細(xì)胞到達(dá)感染部位識(shí)別病毒感染的DC，啟動(dòng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，為適應(yīng)性免疫應(yīng)答提供條件，Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生可抑制病毒感染的傳播并導(dǎo)致大量趨化因子IP-10的產(chǎn)生。最近研究指出，CXCL10缺乏的小鼠對(duì)DEN易感，除了缺乏募集淋巴細(xì)胞的能力，還缺乏促進(jìn)病毒清除的抗病毒活性［21］。因此IP-10在抗DEN中發(fā)揮重要作用，它可通過(guò)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答和直接的抗病毒方式以發(fā)揮抗病毒作用。本研究證實(shí)DEN2感染組IP-10的分泌在感染后24小時(shí)較正常組明顯升高，48小時(shí)達(dá)頂峰，72小時(shí)又有所下降，但仍遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組。IP-10可使Th1細(xì)胞聚集在病毒感染的部位而發(fā)揮Th1型免疫應(yīng)答，48小時(shí)病毒復(fù)制達(dá)最高峰，此時(shí)IP-10的分泌也達(dá)頂峰，可使IL-12等細(xì)胞因子聚集，為募集Th1細(xì)胞創(chuàng)造條件，激活初始T細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答;此外，它直接抗病毒作用的發(fā)揮也使DEN2在BMDC內(nèi)的核酸水平在72小時(shí)有所下降。

本課題組研究已證實(shí)，小鼠被DEN2感染后，血清中Th1、Th2類(lèi)細(xì)胞因子水平發(fā)生變化［22］。在本研究中DEN2感染BMDC后，觀察到TLR7、MyD88及NF-κB的表達(dá)變化和IFN-α、IP-10分泌的明顯增加，結(jié)合BMDC內(nèi)DEN核酸水平的變化，可證明在DEN2感染BMDC后，可改變MyD88依賴(lài)型信號(hào)通路并促進(jìn)IFN-α、IP-10的產(chǎn)生，抑制病毒的復(fù)制，在抗DEN感染的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮一定作用。

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