周豪杰 聶詠梅 李曉帆 汪傳喜

(廣州血液中心，廣州510095)

人類血小板抗原(Human platelet antigen，HPA)是由血小板膜糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，具有單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，遺傳表現(xiàn)為雙等位共顯性遺傳［1］。HPA抗原不配合可導(dǎo)致一系列血小板同種免疫癥的出現(xiàn)，如輸血后紫癜 (PTP)、血小板輸注無(wú)效(PTR)和新生兒同種免疫血小板減少癥(NAIT)等［1，2］。

HPA-21w抗原位于血小板膜糖蛋白GPIIIa上，GPIIIa膜糖蛋白由位于第17號(hào)染色體長(zhǎng)臂的GP3A基因所編碼，是一個(gè)90 kD的單鏈蛋白［3］。HPA-21bw抗原于2010年在1例NAIT病人家系中被首次檢出［4］。本文報(bào)告在中國(guó)大陸地區(qū)首次檢出罕見(jiàn)血小板抗原HPA-21bw等位基因攜帶者2例。

1 材料與方法

1.1 DNA樣本 調(diào)查對(duì)象為隨機(jī)抽取的本血液中心200名無(wú)血緣關(guān)系的無(wú)償血小板獻(xiàn)血者，均為漢族并知情同意，留取靜脈血樣，EDTA抗凝。采用Blood Purfication DNA分離試劑盒(Promega，美國(guó))制備基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HPA-21w PCR-SSP基因分型 采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(Polymerase chain reaction-Sequence specific primers，PCR-SSP)檢測(cè) HPA-21w等位基因。根據(jù)GeneBank基因庫(kù)HPA-21w序列信息［4］，采用 Primer Premier 5.0 軟件自行設(shè)計(jì) HPA-21w的PCR-SSP引物，包括兩條特異性引物和一條公共引物，引物序列為:HPA-21a:5'-ACCGGGGAGCCCTACATGATG-3';HPA-21b:5'-ACCGGGGAGCCCTACATGATA-3';HPA-21common:5'-GCCTGCACAACATTCCCTGAGGT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 204 bp。引入一對(duì)內(nèi)參引物用于擴(kuò)增人生長(zhǎng)激素(Humangrowth hormone，HGH)基因［5］，序列為:HGH-F:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3';HGH-R:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為434 bp。

每個(gè)DNA樣本擴(kuò)增兩個(gè)PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增等位基因HPA-21a和HPA-21b。反應(yīng)體系25 μl，包括2.5 μl 10 × Buffer(TaKaRa，大連)，0.2 mmol/L dNTP(TaKaRa，大連)，1 U rTaq 聚合酶(TaKaRa，大連)，0.5 μmol/L HPA 引物，0.15 μmol/L HGH 引物，2 μl基因組 DNA 約 40 ng，補(bǔ)滅菌水至 25 μl。在PTC-200擴(kuò)增儀(Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為:95℃ 5分鐘預(yù)變性;95℃ 40秒，61℃50秒，72℃ 40秒，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸7分鐘。取8 μl產(chǎn)物凝膠電泳并拍照。

1.3 DNA測(cè)序 設(shè)計(jì)包含HPA-21w抗原SNP位點(diǎn)的正向引物5'-GGGAAGCAGAAGTGGTGGAT-3'和反向引物5'-TTAATGGAGGTGGAGCAGCTTTC-3'，擴(kuò)增GPIIIa編碼基因的exon 11，產(chǎn)物長(zhǎng)度為433 bp。PCR 反應(yīng)體系 25 μl，包括 2.5 μl 10 × Buffer，0.2 mmol/L dNTP，1 U rTaq 聚合酶，引物各 0.2 μmol/L，2 μl基因組 DNA 約 40 ng，補(bǔ)滅菌水至 25 μl。擴(kuò)增參數(shù):95℃ 5分鐘預(yù)變性;95℃ 40秒，61℃50秒，72℃ 40秒，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸7分鐘。產(chǎn)物送北京華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié)果

圖1為2例代表性DNA樣本HPA-21w PCRSSP基因分型格局圖:每個(gè)樣本包含兩個(gè)泳道，分別代表HPA-21a和-21b等位基因PCR電泳結(jié)果，所有泳道在434 bp處的條帶為HGH內(nèi)參照，在204 bp處的HPA陽(yáng)性條帶表示具有相對(duì)應(yīng)的等位基因，因此例1為HPA-21a/a純合子，例2為HPA-21a/b雜合子，其余樣本結(jié)果判讀類同。在200例無(wú)關(guān)漢族血小板獻(xiàn)血者分型過(guò)程中發(fā)現(xiàn)2例罕見(jiàn)HPA-21bw等位基因攜帶者，表型為HPA-21a/b雜合子，其余DNA樣本分型結(jié)果均為HPA-21a/a純合子。2例HPA-21bw攜帶者中，一例為女性，年齡32歲，B型，Rh陽(yáng)性;另一例為男性，年齡22歲，A型，Rh陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)中，分別3次抽提該2例雜合子DNA樣本進(jìn)行HPA-21w基因分型，結(jié)果均一致，為HPA-21a/b雜合子。HPA-21bw等位基因頻率為0.50%。

圖2為該2例HPA-21a/b雜合子及另外2例HPA-21a/a純合子獻(xiàn)血員DNA樣本的測(cè)序結(jié)果圖:例1和例2在GPIIIa編碼基因1960位為G/A雙峰，為HPA-21a/b雜合子;例3和例4則為G/G單峰，因此為HPA-21a/a純合子。2例HPA-21a/b雜合子測(cè)序結(jié)果已在GeneBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)分別為KC155823和 KC155824。

圖1 HPA-21w PCR-SSP基因分型格局圖Fig.1 The pattern of HPA-21w genotyped by PCR-SSP

圖2 GPIIIa編碼基因exon 11擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序圖Fig.2 DNA sequencing chromatogram of the amplified product of GPIIIa exon 11

3 討論

目前，已有33個(gè)HPA抗原被正式命名，其中HPA-1至HPA-5以及HPA-15由于存在a和b對(duì)偶抗原而被列入6個(gè)遺傳系統(tǒng)，其余21個(gè)HPA抗原(包括HPA-6w至HPA-14w以及HPA-16w至HPA-27w)由于對(duì)偶抗原未被檢出而未達(dá)到系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，并在等位基因數(shù)字后加后綴w進(jìn)行表示［1，6］。非系統(tǒng)的HPA抗原均為低頻抗原，呈現(xiàn)出家族個(gè)體性的特點(diǎn)［7］，在臨床中主要表現(xiàn)為由于胎兒攜帶了父親的HPA抗原而與母親不配合，導(dǎo)致母親對(duì)胎兒的同種免疫而誘發(fā) NAIT［7，8］。因此這些低頻 HPA 抗原主要與NAIT有關(guān)，而在血小板輸注中不配合的幾率較?。?］。

Peterson等于2010年在1例美國(guó)NAIT病人家系中首次報(bào)道HPA-21bw抗原，其多態(tài)性是由于GPIIIa編碼基因1960位G＞A單核苷酸取代，導(dǎo)致GPIIIa蛋白628位谷氨酸被賴氨酸取代而引起［4］。Peterson等［4］對(duì)美國(guó)人群的調(diào)查未能檢出 HPA-21bw等位基因(0/100);另一項(xiàng)調(diào)查卻顯示HPA-21bw在日本人群中存在等位基因分布(0.53%，10/1 888)，并且在日本人群中發(fā)現(xiàn)有3例 NAIT由HPA-21bw抗原同種免疫引起，研究人員因此認(rèn)為HPA-21bw是日本人群的一個(gè)特征抗原［9］。隨后Peterson等［10］在美國(guó)進(jìn)行的一項(xiàng)多人群調(diào)查顯示在美國(guó)黑人、高加索人和拉丁裔人群均未檢出HPA-21bw等位基因，但在亞裔人群存在HPA-21bw等位基因分布(0.56%，6/531);Peterson 等［10］還發(fā)現(xiàn) 1例亞裔NAIT病例與HPA-21bw同種免疫有關(guān)，并且指出首次報(bào)道的NAIT病例可能不是美國(guó)人。這些研究結(jié)果表明，HPA-21bw在亞裔人群并不局限于個(gè)別NAIT家系，而在普通人群中存在等位基因分布［9，10］。中國(guó)人群目前尚缺乏 HPA-21w 多態(tài)性調(diào)查數(shù)據(jù)，并且未有HPA-21bw等位基因報(bào)道。

本調(diào)查采用PCR-SSP法對(duì)中國(guó)人群進(jìn)行了HPA-21w基因分型，結(jié)果在200例漢族血小板獻(xiàn)血者中發(fā)現(xiàn)2例HPA-21a/b雜合子，經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)并在GeneBank注冊(cè)。本項(xiàng)調(diào)查首次在中國(guó)大陸人群報(bào)道HPA-21bw等位基因，填補(bǔ)了中國(guó)人群HPA分型資料中的空白。調(diào)查顯示HPA-21bw在中國(guó)人群的等位基因頻率(0.50%)與日本人群相當(dāng)(0.53%)，符合亞裔人群(基因頻率 0.56%)的人群分布特征［9，10］。

目前中國(guó)人群未有HPA-21bw誘發(fā)NAIT的病例報(bào)道，本調(diào)查提示HPA-21bw是誘發(fā)NAIT的一個(gè)潛在抗原位點(diǎn)，因此在臨床實(shí)踐中值得關(guān)注。同時(shí)由于HPA-21bw在中國(guó)普通人群中存在等位基因分布，因此在血小板同種免疫癥的診斷以及血小板輸注治療中，該抗原均具有臨床意義。

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