袁 青 黃 黎 郭夕源 葉迎春 年四季

(瀘州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州646000)

白細(xì)胞介素(IL)IL-4和IL-13表達(dá)于2型輔助性T細(xì)胞(Th2)和肥大細(xì)胞上，是遺傳性過(guò)敏癥和過(guò)敏性炎癥疾病如哮喘發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的細(xì)胞因子［1，2］。IL-4和 IL-13都可促進(jìn)急性炎性過(guò)程和呼吸道基本結(jié)構(gòu)的變化，促進(jìn)其受體在多種類型的細(xì)胞上表達(dá)［3］。遺傳性過(guò)敏癥和過(guò)敏性炎癥疾病的一個(gè)共同關(guān)鍵特征是活化的B淋巴細(xì)胞上免疫球蛋白M向免疫球蛋白E種型轉(zhuǎn)換，而免疫球蛋白M向E轉(zhuǎn)換在很大程度上是受IL-4/IL-13細(xì)胞因子途徑激活的影響［4］。IL-4和IL-13信號(hào)通過(guò)一共同的途徑:在T細(xì)胞表面，通過(guò)由IL-4受體 α鏈(IL-4Rα)和共同g鏈之一(用于結(jié)合IL-4和IL-13)或IL-13受體α鏈(IL-13Rα)(專一用于IL-13結(jié)合)組成的異質(zhì)二聚體促進(jìn)IL-4和IL-13的結(jié)合。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通過(guò)酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT6)的磷酸化所啟動(dòng)，一旦磷酸化，STAT6分子形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE［5-7］。此外，IL-4和IL-13還參與多種免疫調(diào)節(jié)和促炎活化，對(duì)過(guò)敏性炎癥及哮喘起著誘導(dǎo)、增強(qiáng)及控制的作用。

基于IL-4和IL-13信號(hào)途徑在過(guò)敏性炎癥疾病中所發(fā)揮的重要作用，制備中和性抗IL-4和IL-13雙特異性抗體，從而封阻它們的生物學(xué)活性，對(duì)于過(guò)敏性炎性疾病的控制具有很大的潛力。本研究從前期構(gòu)建的天然人源抗體文庫(kù)中分別篩選抗IL-4和IL-13單鏈抗體，以用于后期IL-4/IL-13雙特異性抗體的構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 材料 人外周血取自健康志愿者;mRNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;pET的directional TOPO expression kits購(gòu)自 Invitrogen公司;Oligo dT15和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司;Ni-NTA親和純化系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司;DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為New England Biolabs公司的100 bp DNA ladder;蛋白Marker為TaKaRa公司的低分子量蛋白Marker;蛋白預(yù)染Marker為Invitrogen公司的BenchMarkTMpre-stained protein ladder。大腸桿菌TG1、輔助噬菌體M13K07及pCANTAB-5E噬菌體載體均購(gòu)自Gene公司。

1.2 方法

1.2.1 IL-4和IL-13基因擴(kuò)增 從健康志愿者外周血中分離單核細(xì)胞，采用mRNA提取試劑盒提取mRNA(Invitrogen，USA)。以mRNA為模板，用Oligo dT15、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(promega，USA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。從NCBI中下載人IL-4和IL-13基因序列，設(shè)計(jì)引物。用于擴(kuò)增IL-4的上游引物IL-4F:5'-CACCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGC-3';下游引物 IL-4R:5'-GGAATTCAAGCCCGCCAGGCC-3'。用于擴(kuò)增IL-13的上游引物IL-13F:5'-CACCTGCCTTGGCGGCTTTGCCTCC-3';下游引物 IL-13R:5'-AGCTGAGACCTTGTGCGGGCA-3'。上游引物 5'端添加了4個(gè)堿基CACC用于PCR產(chǎn)物直接連接到pET102/D-TOPO載體上。取合成的 cDNA 2 μl作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 2分鐘，然后94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，35次循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

1.2.2 IL-4、IL-13的表達(dá)純化 取 IL-4、IL-13 PCR產(chǎn)物按照pET Directional TOPO expression kit(Invitrogen，USA)說(shuō)明書進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化入E.coli One Shot-TOPO，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的DNA序列正確后，將含正確插入序列的pET102/IL-4、pET102/IL-13陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli BL21，過(guò)夜培養(yǎng)后取2 ml接種到含50 μg/ml羧芐青霉素的100 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至A600=0.5左右，加入終濃度為1 mmol/L IPTG于30℃培養(yǎng)5小時(shí)后，8 000 r/min離心培養(yǎng)液10分鐘，收集沉淀保存用于SDS-PAGE鑒定和后續(xù)純化。

按照購(gòu)自Invitrogen公司的Ni-NTA親和純化系統(tǒng)中Hybrid(雜交法)純化得到有生物學(xué)活性的IL-4和IL-13蛋白，并進(jìn)行 Western blot鑒定。由于pET102/D-TOPO載體帶有6×His-tag，表達(dá)純化的蛋白采用抗組氨酸單克隆抗體(GE Healthcare，來(lái)源于小鼠)和馬抗小鼠IgG抗體(Promega，USA)進(jìn)行鑒定，最后加入底物NBT/BCIP進(jìn)行顯色。

1.2.3 抗IL-4、IL-13人源單鏈抗體的篩選 前期工作已構(gòu)建了天然人源性scFv抗體文庫(kù)，文庫(kù)容量達(dá)到了 2.5 ×108，多樣性良好［8］。純化的 IL-4 或IL-33蛋白根據(jù)EZ-Link?Sulfo-NHS-LC-Biotinylation試劑盒(Thermo Scientific)進(jìn)行生物素化。約5×1011TU新鮮制備的scFv抗體文庫(kù)噬菌體用封閉液(1×PBS緩沖液中含3%BSA，0.05%Tween 20)于室溫封閉1小時(shí)，加入10 μg生物素化蛋白于封閉后的scFv抗體文庫(kù)噬菌體中，于37℃緩慢振蕩孵育1小時(shí);按說(shuō)明書加入鏈霉親和素包被的M-280磁珠(streptavidin-coated Dynabeads M-280，Invitrogen)于混合液中，緩慢室溫振蕩30分鐘捕獲IL-4(IL-13)蛋白-抗IL-4(IL-13)特異性噬菌體復(fù)合體。用PBS/Tween 20洗滌磁珠5～10次，然后用0.1 mol/L HCl(pH2.2)使特異性噬菌體解離，感染大腸桿菌TG1后涂2×YTAG(2×YT平板含100 μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖)，從平板上洗下所有菌落用于噬菌體文庫(kù)擴(kuò)增。生物素化的1 μg IL-4或100 ng IL-13用于第2輪和3輪親和篩選。

1.2.4 噬菌體擴(kuò)增 取40 μl從平板上洗下的抗體文庫(kù)菌懸液加入到40 ml 2×YTAG(2×YT平板含100 μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖)培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至A600=0.2。離心沉淀細(xì)菌，用40 ml 2×YTA(2×YT平板含100 μg/ml氨芐青霉素)重懸細(xì)菌，加入約6×109TU輔助噬菌體 M13K07，37℃靜止感染15分鐘，然后200 r/min 37℃ 振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。加入終濃度20 μg/ml卡拉霉素后于32℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日用PEG/NaCl溶液(20%PEG，2.5 mol/L NaCl)沉淀噬菌體，用1×PBS重懸噬菌體。

1.2.5 噬菌體 ELISA 包被液(50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3，pH9.6)稀釋的 10 μg/ml IL-4 或 IL-13純化蛋白于酶標(biāo)板內(nèi)4℃包被過(guò)夜。次日封閉液(1×PBS含5% 脫脂奶粉和0.05%Tween-20)37℃封閉酶標(biāo)孔1小時(shí)，洗滌酶標(biāo)板。加入等倍體積封閉夜室溫封閉30分鐘的噬菌體溶液，37℃孵育1小時(shí)。洗滌酶標(biāo)板后，加入HRP標(biāo)記抗M13單克隆抗體(Amersham Biosciences)37℃孵育1小時(shí)，最后用TMB顯色液顯色，于450 nm處讀取吸光值(A)。

2 結(jié)果

2.1 IL-4、IL-13的擴(kuò)增 從外周血單核細(xì)胞mR-NA中成功擴(kuò)增得到IL-4和IL-13 cDNA片段。IL-4擴(kuò)增片段為 280 bp，IL-13擴(kuò)增片段為 252 bp，見(jiàn)圖1。經(jīng)序列測(cè)定及NCBI BLAST比對(duì)，所擴(kuò)增的IL-4和IL-13序列正確。

2.2 IL-4、IL-13的純化及鑒定 pET102/D-TOPO融合表達(dá)載體攜帶有氨芐青霉素抗性基因，對(duì)于大多數(shù)蛋白采用氨芐青霉素作為抗性篩選可對(duì)蛋白進(jìn)行很好的表達(dá)。但如果表達(dá)量比較低，那么則可以選擇羧芐青霉素。pET102/D-TOPO融合表達(dá)載體N端攜帶硫氧還蛋白標(biāo)簽，C端V5，6×His標(biāo)簽，有利于增加表達(dá)蛋白的可溶性，并有利于目的蛋白的鑒定。表達(dá)后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE分析，表達(dá)的IL-4目的融合蛋白大小為27 kD，IL-13目的融合蛋白為25 kD左右(包括了兩端連接的標(biāo)簽，圖2)。表達(dá)產(chǎn)物一部分為沒(méi)有生物學(xué)活性的包涵體，也有一部分蛋白為可溶性蛋白。經(jīng)用Ni-NTA親和純化系統(tǒng)純化得到有生物學(xué)活性的可溶性蛋白并進(jìn)行Western blot鑒定，證明表達(dá)純化的蛋白即為目的蛋白IL-4和IL-13(圖2)。

2.3 抗IL-4、IL-13人源單鏈抗體的篩選 對(duì)天然人源scFv抗體文庫(kù)分別用IL-4或IL-13生物素化蛋白作為抗原采用免疫磁珠法進(jìn)行了3輪噬菌體展示篩選后，分別從3輪富集后的抗體文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆子，進(jìn)行單個(gè)克隆子噬菌體擴(kuò)增，采用噬菌體ELISA對(duì)表達(dá)的單個(gè)scFv以抗HRP標(biāo)記的M13單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)3輪富集后，特異性單鏈抗體得到富集，分別有37%左右的 scFv對(duì)IL-4顯示陽(yáng)性，27%左右的scFvs對(duì)IL-13顯示陽(yáng)性(圖3)。

2.4 單鏈抗體的鑒定 挑取分別與IL-4或IL-13結(jié)合能力強(qiáng)的4株單鏈抗體，進(jìn)行了表達(dá)、純化和Western blot鑒定，結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物在約32 kD處有靶帶，為表達(dá)的單鏈抗體(圖4)。說(shuō)明從天然的人源抗體文庫(kù)中成功地篩選到了抗IL-4和抗IL-13單鏈抗體，但一般從天然抗體文庫(kù)中篩選到的單鏈抗體其親和力相對(duì)較低，后期我們將根據(jù)篩選到的抗IL-4或IL-13單鏈抗體構(gòu)建突變文庫(kù)，以篩選到高親和力單鏈抗體。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增IL-4和IL-13 cDNAFig.1 Amplifaction of the cDNA of IL-4 or IL-13 by RT-PCR

圖2 SDS-PAGE和Western blot鑒定純化的IL-4、IL-13蛋白Fig.2 Purification and identification of IL-4 and IL-13 by Western blot

圖3 ELISA篩選抗IL-4、IL-13單鏈抗體Fig.3 Selection of scFvs against IL-4 or IL-13 by ELISA

圖4 SDS-PAGE和Western blot鑒定純化的抗IL-4、IL-13單鏈抗體Fig.4 Identification of purified scFvs against IL-4 or IL-13 by SDS-PAGE and Western blot

3 討論

IL-4和IL-13由Th2和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)激活嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞促進(jìn)氣道炎癥，增強(qiáng)纖維母細(xì)胞的增殖/活化引起氣道重塑;激活B細(xì)胞產(chǎn)生IgE;刺激氣道上皮細(xì)胞/杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏液;激活氣道平滑肌細(xì)胞引起氣道高反應(yīng)性［9］，在過(guò)敏性炎癥疾病如哮喘中起著重要的作用。靶作用于IL-4和IL-13的生物復(fù)合物可為嚴(yán)重過(guò)敏性炎癥病人提供新的治療手段。小鼠哮喘模型中，單獨(dú)敲除或封阻IL-4能抑制過(guò)敏性炎癥應(yīng)答和其他哮喘癥狀［10］。研究發(fā)現(xiàn)一種包含人源IL-4R-α鏈胞外蛋白的可溶性IL-4受體片段(Altrakincept)，能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制IL-4與受體結(jié)合，在早期研究中對(duì)人輕度和中度哮喘有一定的效果，但對(duì)頑固性哮喘作用不明顯［11］。而又有一些研究者發(fā)現(xiàn)用抗IL-13單克隆抗體或可溶性受體可減少肺部炎癥、降低氣道反應(yīng)性、減少黏液分泌［12］。但單獨(dú)阻斷 IL-4或IL-13一種細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，其治療效果并不特別理想。通過(guò)深入研究哮喘等過(guò)敏性炎癥疾病的致病機(jī)理，IL-4/IL-13信號(hào)途徑在其致病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，若同時(shí)封阻IL-4和IL-13生物學(xué)活性，將會(huì)取得更好的治療效果。

本研究中使用的抗體文庫(kù)為人源天然抗體文庫(kù)，從天然抗體文庫(kù)中篩選的單鏈抗體一般親和力較低，所以后期本研究小組將針對(duì)篩選的抗IL-4和IL-13單鏈抗體分別構(gòu)建突變文庫(kù)，從而篩選到高親和特異性的抗IL-4和IL-13單鏈抗體，為抗IL-4和IL-13雙特異性的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

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