王 萍 胥 冰 張麗君

(陜西中醫(yī)學(xué)院免疫教研室，咸陽712046)

乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染機(jī)體后所引起的疾病，嚴(yán)重危害我國人民身體健康。乙型肝炎特別是慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，近年來研究證實(shí)宿主免疫功能紊亂是其發(fā)病的重要原因，但確切機(jī)制尚未完全清楚［1］。Treg/Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的具有特異細(xì)胞膜表面分子和核轉(zhuǎn)錄因子的兩類細(xì)胞亞群［2，3］，國內(nèi)外研究表明Treg/Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病、腫瘤及感染性疾病中發(fā)揮重要作用［4，5］，有研究資料顯示Treg/Th17細(xì)胞在HBV感染疾病中也發(fā)揮一定作用［6-9］，但研究結(jié)果并不一致，且大多數(shù)研究只針對一種類型HBV感染的Treg或Th17細(xì)胞進(jìn)行分析，缺乏同時(shí)對不同類型HBV感染類型Treg/Th17細(xì)胞的系統(tǒng)研究。為進(jìn)一步研究Treg/Th17細(xì)胞在不同類型HBV感染中的作用，本研究擬通過對不同類型HBV感染者外周血Treg/Th17細(xì)胞、核轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子的分析，初步探討Treg/Th17細(xì)胞在HBV感染過程中的變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入選2011年10月至2012年6月在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院和門診治療的不同類型乙型肝炎患者95例，其中急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者15例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者40例、無癥狀攜帶者(asymptomatic HBV carriers，AsC)40例，其中男性59例，女性36例，年齡21～64歲，平均年齡(38.75±16.57)歲。所有病例診斷符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》［10］，所有病例均排除HAV、HCV、HDV、HEV等其他病毒性疾病、自身免疫性和藥物及酒精性肝炎等，在進(jìn)行采集樣本前未進(jìn)行抗病毒治療和免疫調(diào)節(jié)治療。另外選擇同期健康體檢者30例作為對照組，其中男性17例，女性13例，年齡20～62歲，平均年齡(36.87 ±15.37)歲，兩組研究對象性別、年齡的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究得到我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得所有受試者的知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 美國貝克曼公司生產(chǎn)的FACS Calibur流式細(xì)胞儀;美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR擴(kuò)增儀;芬蘭 Thermo公司生產(chǎn)的DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀;鼠抗人FITC-CD4、Alexa Fluor?647-IL-17、PE-Foxp3、PE 標(biāo)記IgG同型對照、Alexa Fluor?647標(biāo)記IgG同型對照購自美國 eBioscience公司;佛波酯、離子霉素(Ionomycin)購自Calbiochem公司;TRIzol液購自美國Invitrogen公司;cDNA第一鏈合成試劑盒購自立陶宛Fermentas公司;SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑購自TaKaRa生物科技有限公司;人 TGF-β1、IL-17 ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 方法

1.3.1 Th17細(xì)胞檢測 取外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液250 μl，加入 PMA(50 ng/ml)、離子霉素(500 ng/ml)培養(yǎng)2小時(shí)后加入BD GolgiPlugTM蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(1 μl/ml)，混勻后37℃、5%CO2條件下孵育4 小時(shí)。加入20 μl FITC-CD4抗體，溫和混勻，常溫下避光孵育20分鐘;依次加入2 ml預(yù)先準(zhǔn)備的預(yù)冷(4℃)1×固定液、2 ml預(yù)先準(zhǔn)備的溫(37℃)1×破膜液，37℃避光孵育30分鐘;加入20 μl Alexa Fluor?647-IL-17抗體，室溫避光孵育20分鐘，洗滌細(xì)胞后應(yīng)用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測，通過Cellquest軟件進(jìn)行收集分析數(shù)據(jù)。

1.3.2 CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞檢測 在 250 μl外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入20 μl FITC-CD4抗體常溫下避光孵育20分鐘，加入Foxp3 buffer工作液孵育30分鐘后加入20 μl PE-Foxp3，室溫避光孵育20分鐘，洗滌細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定Foxp3/RORγt mRNA的表達(dá) 利用TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，利用Fermentas試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。參照 Genbank cDNA序列設(shè)計(jì) Foxp3、RORγt及GAPDH引物，具體序列如下:Foxp3 5'-TTCCTTGAACCCCATGCCAC-3'，5'-TGAAATGTGGCCTGTCCTGG-3'，產(chǎn)物大小 131 bp;RORγt 5'-GAGCCAAGGCTCAGTCATGAGAA-3'，5'-GTCCCTCTGCTTCTTGGACAT-3'，產(chǎn)物大小289 bp;GAPDH 5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，5'-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3'，產(chǎn)物大小231 bp。用20 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃ 30秒預(yù)變性，95℃ 5秒、60℃ 30秒40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后采用Bio-Rad iQ520 Standard Edition Optical System Software V2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 ELISA 檢測血漿 TGF-β1、IL-17 水平 利用ELISA試劑盒檢測TGF-β1、IL-17水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，當(dāng)P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)再進(jìn)行組間比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者外周血CD4+Foxp3+Treg/Th17細(xì)胞百分率變化 流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示CHB組患者外周血CD4+Foxp3+Treg/CD4+T細(xì)胞百分率為(11.27 ±3.17)%，與正常對照組(8.95 ±2.87)%相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但AHB組、AsC組患者外周血CD4+Foxp3+Treg/CD4+T細(xì)胞百分率分別為(9.68±2.98)%、(10.25±2.98)%，與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖1A。與正常對照組(0.94±0.28)%相比，AHB組、CHB組患者外周血中CD4+IL-17+/CD4+T細(xì)胞百分率(1.34±0.36)%、(1.26±0.32)%顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而AsC組患者外周血中CD4+IL-17+/CD4+T細(xì)胞百分率為(1.07±0.31)%，與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見圖1B。

圖1 各組患者外周血CD4+Foxp3+Treg/Th17細(xì)胞百分率變化Fig.1 The changes of the percentage of CD4+Foxp3+Treg/Th17 cells in the peripheral blood of different groups

2.2 各組患者Foxp3/RORγt mRNA表達(dá)水平比較Foxp3/RORγt是Treg/Th17細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測了各組患者外周血Foxp3/RORγt mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。與正常對照組(0.42±0.11)相比，CHB組患者外周血Foxp3 mRNA 表達(dá)水平(0.56±0.21)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但 AHB組(0.46±0.15)、AsC 組(0.48 ±0.17)患者外周血 Foxp3 mRNA表達(dá)水平與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AHB 組(0.57 ±0.23)、CHB 組(0.51 ±0.16)患者外周血中RORγt mRNA表達(dá)水平與正常對照組(0.39±0.12)相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);而 AsC 組(0.43 ±0.11)患者外周血中RORγt mRNA表達(dá)水平與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖2 各組患者Foxp3/RORγt mRNA表達(dá)水平比較Fig.2 The comparison of the mRNA expression of Foxp3/RORγt in different groups

2.3 各組患者血漿中 TGF-β1、IL-17水平變化CHB組患者外周血TGF-β1水平明顯升高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但AHB組、AsC組患者外周血TGF-β1水平與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。與正常對照組相比，AHB組、CHB組患者外周血中IL-17水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而AsC組患者外周血中IL-17水平與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，結(jié)果見表1。

表1 各組患者血漿中TGF-β1、IL-17水平變化Tab.1 Changes of the plasma levels of TGF-β1/IL-17 in different groups

3 討論

隨著對乙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乙型肝炎病毒造成的肝臟損傷及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體細(xì)胞免疫功能及免疫耐受密切相關(guān)［1］。CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答中的重要部分，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Treg/Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的具有特異細(xì)胞膜表面分子和核轉(zhuǎn)錄因子的兩類CD4+T細(xì)胞亞群，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，而RORγt是Th17細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子［2，3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)在Ⅰ型糖尿病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病和重癥肌無力等自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞數(shù)量減少，免疫抑制功能受損，而Th17細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化等自身免疫性疾病中數(shù)量增多［4，5］。

最近研究發(fā)現(xiàn) Treg/Th17細(xì)胞在 HBV、HCV、HIV、巨細(xì)胞病毒等感染過程也發(fā)揮一定作用［11，12］，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Treg/Th17細(xì)胞在HBV感染疾病中也發(fā)揮一定作用［6-9］，但研究結(jié)果并不完全一致，可能與每個(gè)研究的病例選擇、采樣時(shí)間、Treg/Th17細(xì)胞檢測分選手段不同及流式細(xì)胞儀檢測靈敏度等因素有關(guān)。為了進(jìn)一步研究Treg/Th17細(xì)胞在HBV發(fā)病中的具體作用，我們對不同類型HBV感染者外周血中Treg/Th17細(xì)胞、核轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行了分析。研究證實(shí)Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，因此我們利用CD4+Foxp3+作為檢測Treg細(xì)胞的標(biāo)記;目前對Th17細(xì)胞的檢測大多采用CD4+IL-17+標(biāo)記，本實(shí)驗(yàn)也利用CD4+IL-17+作為檢測Th17細(xì)胞的標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同類型 HBV感染中，CD4+Foxp3+Treg/Th17細(xì)胞數(shù)量發(fā)生不同變化。在AHB中，主要是Th17細(xì)胞明顯增多，其轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA及效應(yīng)分子IL-17的水平也明顯升高，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果一致［7，13，14］，而 CD4+Foxp3+Treg/細(xì)胞、Foxp3 mRNA及TGF-β1水平無明顯變化，但有研究結(jié)果顯示AHB患者Treg細(xì)胞減少，這可能與采集樣本的時(shí)間及流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記方法不一致有關(guān)［15］。在HIV的研究中發(fā)現(xiàn)，病毒感染早期IL-17的水平及Th17細(xì)胞數(shù)量有所增加，提示Th17細(xì)胞可能在病毒感染急性期發(fā)揮作用［16］。而在 CHB患者體內(nèi) CD4+Foxp3+Treg//Th17細(xì)胞數(shù)量均升高，但以CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞升高為主，這與國內(nèi)外研究結(jié)果基本一致［6-8］。AsC患者雖然CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞雖然與正常對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但數(shù)量還是高于正常對照組，而Th17細(xì)胞數(shù)量與正常對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究證實(shí)在一定的條件特別是在不同細(xì)胞因子作用下，Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞之間可以相互轉(zhuǎn)化保持機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，不同類型HBV感染者體內(nèi)Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞之間可能互相轉(zhuǎn)化，進(jìn)而發(fā)揮不同的作用。

綜合目前國內(nèi)外研究及我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為在AHB中Th17細(xì)胞發(fā)揮主導(dǎo)作用，Th17細(xì)胞在HBV感染的急性期可能發(fā)揮了促進(jìn)炎癥、引起病理損傷的效應(yīng)，導(dǎo)致肝臟炎癥和免疫損傷;在CHB中以Treg細(xì)胞升高為主，主要發(fā)揮免疫抑制作用，病毒無法清除，同時(shí)Th17細(xì)胞數(shù)量也增高，導(dǎo)致一定程度的免疫損傷;在AsC患者體內(nèi)，Treg細(xì)胞在一定程度上增高，發(fā)揮了一定的免疫抑制作用，而Th17細(xì)胞數(shù)量無變化，此時(shí)病毒長期存在，但不表現(xiàn)肝細(xì)胞損傷?？傊?，Treg/Th17細(xì)胞在不同類型的HBV感染中可能發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮不同的作用，但Treg/Th17細(xì)胞失衡的原因及其在HBV發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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