李 沂 李 昌 杜壽文 王茂鵬 朱羿龍 劉存霞 秦艷青 金寧一

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118)

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane proteins，IFITMs)是在干擾素刺激后產(chǎn)生的一組蛋白，其家族成員包括4個序列高度相關(guān)的膜表面蛋白，即 IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5，它們均在細胞生長的不同階段發(fā)揮一定的生物學(xué)功能［1，2］，F(xiàn)riedman 等［3］在1984年首先描述了這種蛋白，IFITM1、IFITM2和IFITM3在多數(shù)組織和細胞中廣泛表達，而IFITM5僅表達在成骨細胞中(Osteoblasts)，它們可能參與體內(nèi)多項生理活動，包括細胞粘著、腫瘤形成、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生殖細胞歸巢和成熟、骨鹽沉積等［1，4］。然而，目前除 IFITM5蛋白在骨鹽沉積中的作用已經(jīng)確定外，其他成員的功能還不完全清楚［5］。

IFITM2作為該家族的重要成員之一，其又名1-8D，在抗腫瘤和抗病毒感染中的作用逐漸被揭示［6-8］。Abraham 等［9］2009 年在 Cell雜志上報道了IFITM2蛋白對流行性感冒病毒(Influenza A virus，IAV)、西尼羅病毒(West Nile vius，WNV)和登革熱病毒(Dengue virus，DNV)具有一定的抑制效果，引起了人們對IFITM2蛋白抗病毒作用的廣泛關(guān)注，相繼有IFITM2抑制SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus)、埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、馬爾堡病毒(Marburg virus，MARV)以及人免疫缺陷病毒I型(Human immuno-deficiency virus，HIV-1)等感染的報道［10，11］。

前期，我們對IFITMs家族的IFITM3蛋白進行了克隆表達研究［12］，本研究擬通過干擾素(Interferon)誘導(dǎo)人胚腎HEK293T細胞，進行IFITM2的RTPCR擴增，并將其亞克隆至真核表達載體中，開展其表達、鑒定及抑制病毒研究，從而為ifitm2基因的進一步功能研究和抗病毒臨床應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)，目前國內(nèi)尚未見相關(guān)研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌(毒)種與載體 人胚胎腎HEK293T細胞由本實驗室保存，大腸桿菌 E.coli DH5α、真核表達載體 PVAX1由本實驗室保存，pMD18-T simple Vector為TaKaRa公司產(chǎn)品，含有增強型綠色熒光蛋白EGFP的VSV-G假膜病毒由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 Recombinant Human IFN-α2B(rhIFN-α2B)購自 PEPROTECH Asia 公司，內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶、Ex Tap聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、dNTP和RNA酶抑制劑均為TaKaRa公司產(chǎn)品，UNIQ-10柱式總RNA提取試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自百泰克公司，胎牛血清(FCS)和DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體為Invitrogen產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔源IFITM2抗體購自ProteinTech公司，鼠源β-actin抗體購自聯(lián)科生物公司，ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光溶液為Themo公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。英國TECHNE TC512 PCR儀;Thermo Scientific公司的NANODROP 2000核酸蛋白檢測儀;激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考GenBank中人ifitm2基因序列(Accession No.:NM_006435)設(shè)計引物，其中上游添加BamHⅠ及Kozak序列;下游添加EcoRⅠ及6-His-tag標簽，序列為:上游引物IF1:ggggatccgccaccatgaaccacattgtgcaaac;下游引物IF2:gggaattcctagtggtggtggtggtggtgtcgctgggcctggacga，由大連寶生物公司合成。

1.2.2 ifitm2基因的克隆 將指數(shù)生長期的HEK293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×106個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜。48小時后加入5 μl的 1.33 × 10－5g/ml的 rhIFN-α2B 稀釋液，37℃，5%CO2繼續(xù)孵育12小時，收集細胞，3 000 r/min離心5分鐘，棄上清，提取細胞總RNA(方法參照生工Trizol-柱式總RNA提取試劑盒說明書)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用引物IF1、IF2進行PCR擴增，反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為:95℃變性5分鐘;94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒;40個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T simple Vector載體，BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切初步鑒定正確后，命名為pMD-IFITM2，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 pV-IFITM2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切經(jīng)測序正確的pMD-IFITM2，凝膠回收420 bp左右的目的片段，并與相同酶切的PVAX1載體相連，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上進行篩選，挑取陽性單菌落，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，將鑒定正確質(zhì)粒命名為pV-IFITM2，大量制備與純化，測定質(zhì)粒濃度，用于細胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 6孔細胞培養(yǎng)板中用含10%胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)HEK293T細胞(1×106個/孔)，待細胞生長至80% ～90%時，應(yīng)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞，同時設(shè)空載體PVAX1及空細胞對照。

1.2.5 目的基因的RT-PCR鑒定 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48小時后，采用UNIQ-10柱式總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增ifitm2基因，鑒定基因的轉(zhuǎn)錄情況，同時設(shè)β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 Western blot檢測IFITM2的表達 同上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48小時后，提取細胞總蛋白，用NANODROP 2000對蛋白樣品進行定量，15%SDSPAGE凝膠電泳后，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至 NC(0.45 μm)膜上，5%脫脂乳封閉2小時后，依次與IFITM2一抗(5 000倍稀釋)和HRP-山羊抗兔IgG孵育，化學(xué)發(fā)光ECL法顯跡檢測IFITM2表達，并以β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.7 IFITM2蛋白的激光共聚焦實驗 將指數(shù)生長的HEK293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中(1×106個/孔)，孔底附有玻片，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜。細胞生長至80% ～90%時，進行轉(zhuǎn)染實驗，方法同上1.2.4，轉(zhuǎn)染后待細胞生長到接近單層時，取出玻片，甲醇固定，順次加入IFITM2一抗(2 000倍稀釋)、FITC標記羊抗兔IgG(200倍稀釋)伊文斯蘭(終濃度為0.025%)，室溫避光作用2小時，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.2.8 IFITM2對病毒的抑制作用分析 HEK293T細胞中過表達 IFITM2蛋白48小時后，接入0.1 MOI的含EGFP基因的VSV-G假膜病毒，37℃，5%CO2培養(yǎng)2小時，收集細胞，Western blot進行EGFP表達分析，探討IFITM2蛋白對病毒的抑制作用，同時設(shè)正常細胞感染和PVAX1轉(zhuǎn)染細胞感染對照。

2 結(jié)果

2.1 ifitm2基因的克隆與鑒定 用rhIFN-α2B處理12小時的HEK293T細胞，提取RNA后進行 RTPCR擴增，在420 bp左右可見明顯的擴增條帶(圖1A)，結(jié)果與理論值相符，證明得到ifitm2基因。將ifitm2亞克隆入T載體中，BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切后凝膠電泳可見420 bp的目的片段(圖1B)，證明ifitm2基因片段已連接至T載體中，且測序結(jié)果與GenBank中ifitm2序列一致，證明成功獲得ifitm2基因。

2.2 重組質(zhì)粒pV-IFITM2的構(gòu)建及鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，質(zhì)粒pV-IFITM2經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，可見420 bp的目的基因條帶(圖2)，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 ifitm2基因在HEK293T細胞中的表達鑒定分別提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pV-IFITM2的HEK293T細胞的mRNA與細胞總蛋白，利用RT-PCR與Western blot進行IFITM2轉(zhuǎn)錄與表達的檢測。由圖3A可以看出，在420 bp左右處有明顯條帶，但在空載體PVAX1轉(zhuǎn)染細胞及陰性細胞對照中也同樣出現(xiàn)目的條帶，表明HEK293T細胞中含有內(nèi)源性ifitm2的轉(zhuǎn)錄水平的表達，但與轉(zhuǎn)有IFITM2的質(zhì)粒相比，條帶較弱，表明ifitm2基因在HEK293細胞中獲得正確轉(zhuǎn)錄。由圖3B可以看出，pV-IFITM2轉(zhuǎn)染組在15 kD有明顯條帶，而在空載體轉(zhuǎn)染組和陰性細胞對照組未出現(xiàn)條帶，表明ifitm2基因在HEK293T細胞中正確表達，并具有良好的抗體結(jié)合活性。該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的檢測有所不同，內(nèi)源性的IFITM2雖存在mRNA水平的表達，但由于表達量過低、不能夠翻譯成蛋白或翻譯后很快被降解等原因，從而在蛋白水平檢測不到，該研究結(jié)果與我們對IFITM3的表達研究一致［13］，但原因未明，這也是我們以后研究的一個方向。

圖1 IFITM2的PCR擴增和酶切鑒定Fig.1 Amplification and restriction enzyme digestion of IFITM2

圖2 質(zhì)粒pV-IFITM2的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of plasmid pV-IFITM2

圖3 IFITM2基因mRNA和蛋白表達的檢測Fig.3 The expression of IFITM2 by RT-PCR and Western blot

圖4 IFITM2表達的激光共聚集檢測Fig.4 The expression analysis of IFITM2 by laser scanning confocal microscope

2.4 IFITM2蛋白的激光共聚集檢測 為進一步了解IFITM2的蛋白表達定位情況，在IFITM2過表達24小時后，利用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，在IFITM2過表達的293T細胞中，可看到明顯的綠色熒光，而且整個細胞均出現(xiàn)，表明該蛋白在細胞中呈廣泛表達。

2.5 IFITM2抑制病毒感染的效果檢測 在HEK-293T細胞過表達IFITM2蛋白48小時后(進行IFITM2是否表達的檢測)，接入0.1 MOI的含EGFP的VSV-G假膜病毒，于感染后2小時收集細胞，提取細胞總蛋白，進行EGFP表達的Western blot檢測。結(jié)果如圖5所示，VSV-G假膜病毒感染IFITM2過表達細胞中的EGFP表達量顯著低于正常細胞和載體轉(zhuǎn)染，提示 IFITM2對 VSV-G假膜病毒感染HEK293T細胞具有一定抑制作用。

3 討論

圖5 IFITM2蛋白抑制VSV-G假膜病毒感染HEK293細胞Fig.5 IFITM2 suppress VSV-G pseudotype virus infection

干擾素(IFNs)是一種具有重要生理功能的細胞因子，但IFNs并不直接發(fā)揮作用，其主要通過與其受體(IFNR)結(jié)合，從而誘導(dǎo)大量干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表達，這些ISGs直接或間接發(fā)揮IFNs的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能［13，14］。在這些ISGs中，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane proteins，IFITMs)就是其中一類，自2009年Cell雜志首次揭示干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白家族分子的抗病毒活性以來，因其廣譜的抗病毒活性和獨特的抗病毒作用，成為近年來抗病毒研究的重要分子。IFITM2作為該家族的成員之一，又名1-8D，其在抗腫瘤和抗病毒中亦發(fā)揮重要作用。Tirosh等［6］研究發(fā)現(xiàn)，1-8D基因在結(jié)腸癌細胞中高表達，并且可以作為與結(jié)腸癌相關(guān)的抗原基因，并提出1-8D基因可以作為一種用于CTL介導(dǎo)的免疫治療的潛在抗原識別靶位。Daniel-Carmide等［15］研究表明，IFITM2可以作為一種新型的促凋亡基因。Andreu等［7］研究還表明，IFITM可以作為一種大腸腺癌的標記基因。研究發(fā)現(xiàn)，1-8D在腺病毒感染細胞時，可以與腺病毒DNA復(fù)制中起重要作用的前體末端蛋白(PTP)結(jié)合，并誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制病毒擴散［8］，目前已發(fā)現(xiàn)其能對多種囊膜病毒的進入具有不同程度的抑制作用［4，9-11］，但這種分子發(fā)揮抗病毒的機制尚不清楚。

鑒于此，本研究以ifitm2基因的克隆表達為出發(fā)點，利用干擾素刺激HEK293T細胞，提取基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行iftm2的擴增，而后將測序正確的目的基因片段連接到真核表達載體pVAX1中，開展其表達與定位研究，以期為該分子的抗病毒作用機制研究提供基礎(chǔ)。但在研究中發(fā)現(xiàn)，在mRNA表達水平上，無論是陰性細胞、轉(zhuǎn)染空載體的細胞還是轉(zhuǎn)染了表達目的基因的細胞，都有一定水平的表達，但轉(zhuǎn)染pV-IFITM2質(zhì)粒后，mRNA表達量明顯上升，如圖3A所示，表明在HEK293T細胞中ifitm2在mRNA水平上有內(nèi)源性本底表達。但進行Western blot檢測時，卻在陰性細胞及空載體對照中未發(fā)現(xiàn)IFITM2蛋白的表達，如圖3B所示，此結(jié)果與前人的研究一致［11］。但為什么會存在這種轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平的差異，還需要進一步的研究。

為了驗證本研究表達的IFITM2蛋白是否具有抗病毒功能，以前期構(gòu)建的基于慢病毒載體、能夠表達增強性綠色熒光蛋白(EGFP)且以VSV-G作外膜的假病毒為測試病毒，通過感染IFITM2表達細胞，檢測報告基因EGFP的表達變化，評價IFITM2蛋白的活性。通過檢測感染后2小時報告基因EGFP的表達，提示IFITM2對VSV-G的感染具有一定的抑制作用，至于這種抑制作用是不是發(fā)生在病毒的進入階段，抑制的效率如何，還需要更多的實驗證據(jù)。

總之，本研究率先在國內(nèi)成功擴增了ifitm2基因，開展了其表達與抗病毒活性研究，并取得了預(yù)期結(jié)果。ifitm2基因作為一類新型抗病毒ISGs，在未來病毒病的診斷與治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前臨床上使用干擾素存在一定的副作用，主要是因為直接應(yīng)用干擾素可以誘導(dǎo)成千上百個ISGs的表達，這些ISGs可以發(fā)揮正向的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用，也有可能產(chǎn)生拮抗作用，從而發(fā)現(xiàn)特異的抗病毒ISGs，直接以其作為對象進行抗病毒研究，將具有更強的針對性和更小的副作用，必將成為未來一個重要的研究方向。本文通過對ifitm2基因的成功克隆、表達及抗病毒初步研究，為IFITM2蛋白的進一步臨床應(yīng)用及探其抗病毒作用和分子機制提供了實驗及理論基礎(chǔ)。

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