杜志敏 楊靜靜 馬 倩 王天云 李齊印 徐志強 李萬里

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，新鄉(xiāng)453003)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF家族的成員之一，是一種Ⅱ型膜蛋白，通過與其特異性死亡受體結(jié)合而激活凋亡信號傳導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。大豆甙元(Daidzein，Da)是來源豆類植物和齒狀植物的異黃酮類化合物，是大豆異黃酮的主要成分。近年來大量體外實驗及流行病學(xué)均顯示，Da作為一種抗癌劑具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長與分化及抗氧化作用。近年來研究表明Da能夠抑制乳腺癌、前列腺癌、白血病以及某些肝癌細(xì)胞株的生長，增殖以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［1-3］。Da具有抗癌作用，且毒性低，藥物作用平緩。Da作為一種天然植物雌激素，已被證實具有抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用，因其毒副作用小，抗腫瘤作用日益受到重視。本研究旨在探討低毒性的Da聯(lián)合TRAIL作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞，研究兩者聯(lián)合對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響和細(xì)胞相關(guān)凋亡基因的表達(dá)影響，以初步探討Da與TRAIL聯(lián)合作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞是否具有協(xié)同作用及其作用機制，以期為臨床胃癌防治提供一定的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株(本實驗室建立);DYY-8B電泳儀(北京六一儀器廠);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);CLLNIBI0128酶標(biāo)儀(奧地利Clibibo公司);UV-250紫外分光光度儀(日本SHIMADZU公司);電泳凝膠成像系統(tǒng)(英國SynDZe公司);FACSCALIBUR流式細(xì)胞儀(美國BD公司);電鏡(日立H-7500);切片機(leica-uc6);Daidzein(鄭州荔諾生物科技有限公司);TRAIL(USA Sigma公司);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、兔抗鼠Bcl-2、survivin、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、Ecl發(fā)光液、細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、Tris-HCL平衡苯酚(上海碧云天公司);四噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，USA Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 Da和 TRAIL分別作用于 SGC-7901細(xì)胞 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，96孔板中每孔加入1 000個細(xì)胞。分組設(shè)置:空白對照組(加等量的含0.03%DMSO的 DMEM 培養(yǎng)基)、Da處理組:藥物濃度分別為 20 mg/L(Da1)、40 mg/L(Da2)、80 mg/L(Da3)、160 mg/L(Da4)，TRAIL 處理組:藥物濃度分別為 50 μg/L(T1)、100 μg/L(T2)、200 μg/L(T3)、400 μg/L(T4)分別作用于SGC-7901細(xì)胞。Da和 TRAIL聯(lián)合作用于 SGC-7901細(xì)胞:分組設(shè)置為:空白對照組(加等量的含0.03%DMSO的DMEM培養(yǎng)基)、20 mg/L大豆甙元組(Da1)、50 μg/L TRAIL組(T1)以及兩者聯(lián)合作用于SGC-7901細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測 各組細(xì)胞經(jīng)過藥物刺激后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12、24、48、72小時后，每孔加入MTT 溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 小時，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解甲瓚，溶解后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm的吸收值。每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，利用空白對照組調(diào)零。計算細(xì)胞生長率公式:細(xì)胞抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 FITC-AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過藥物處理24小時后，收集細(xì)胞預(yù)冷PBS清洗兩遍后，收集細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻避光反應(yīng)10分鐘后，再加入5 μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)10分鐘，利用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 PI染色檢測細(xì)胞周期 SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過藥物處理24小時后，收集細(xì)胞，PBS漂洗后重懸細(xì)胞于預(yù)冷的70%乙醇中，－20°C固定24小時以上;固定后離心棄上清，PBS洗滌一次，將細(xì)胞重懸于含50 μg/ml PI和100 μg/ml RNase A 的 PBS中，室溫孵育30分鐘后，利用流式細(xì)胞儀進行檢測細(xì)胞周期。

1.2.5 電鏡檢測 SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過藥物處理后，離心棄上清，加入4%多聚甲醛，在4℃下固定4小時。0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，加入0.5 ml人的新鮮血漿，用鉤針輕輕打散后離心5分鐘，沿管壁輕輕滴入2.5%戊二醛2～3 ml，微波中檔固定5～10秒后，置4℃下固定1小時，用帶鉤的解剖針勾出細(xì)胞團塊，切成1 mm3大小的組織塊，放回2.5%戊二醛中低溫保存。常規(guī)超薄切片樣品制作，透射電鏡日立H-7500觀察。

1.2.6 Western blot檢測 SGC-7901 細(xì)胞中 Bcl-2、caspase-3、survivin蛋白 SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過藥物處理后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行定量。蛋白上樣量30 ug，Western blot檢測蛋白的表達(dá)。Bcl-2一抗的稀釋濃度1∶1 000，caspase-3一抗的稀釋濃度1∶500，survivin一抗的稀釋濃度1∶1 000，二抗稀釋濃度均為1∶1 000，ECL發(fā)光，用膠片捕捉發(fā)光條帶。所得的膠片結(jié)果經(jīng)掃描后，利用ImageJ軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 Da、TRAIL分別對SGC-7901細(xì)胞體外增殖的抑制作用 SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的 Da、TRAIL處理不同的時間后，用MTT法檢測對細(xì)胞的抑制情況。與對照組比，Da、TRAIL對SGC-7901細(xì)胞體外增殖有一定的抑制作用，不同濃度作用不同，隨著濃度的增加作用加強，48小時 Da對SGC-7901細(xì)胞體外增殖的抑制作用達(dá)到高峰(P＜0.01)，當(dāng)TRAIL達(dá)到較高濃度時，腫瘤細(xì)胞的抑制作用隨著濃度的增加而增強(P＜0.01)，見表1。

2.2 Da聯(lián)合TRAIL對SGC-7901細(xì)胞體外增殖的抑制作用 SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過Da或/和TRAIL處理不同的時間后，與對照組相比，Da1(20 mg/L)和T1(50 μg/L)聯(lián)合時，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率隨著聯(lián)合時間的延長，凋亡作用增強，兩種藥物聯(lián)合作用在48小時時抑制率達(dá)46.6%，與對照組及單獨用藥組抑制率相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P ＜0.01)，見表2。

2.3 Da和TRAIL對SGC-7901細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)的影響 SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過Da或/和TRAIL處理24小時后，利用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部的形態(tài)學(xué)變化。正常細(xì)胞呈球形，細(xì)胞核質(zhì)比大，表面有微絨毛;Da1(20 mg/L)處理后，細(xì)胞核體積變小，細(xì)胞膜損傷;T1(50 μg/L)處理后，核膜下可見染色質(zhì)形成斑塊狀凝聚，造成細(xì)胞碎裂。Da1聯(lián)合T1組胞質(zhì)空泡化，出現(xiàn)大量空泡，胞膜破裂，細(xì)胞表面絨毛脫失，細(xì)胞出現(xiàn)崩解，形成了典型的細(xì)胞凋亡特征。見圖1。

2.4 Da和TRAIL對SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過Da或/和TRAIL處理后24后，利用流式細(xì)胞儀檢測各組的凋亡情況。與對照組相比，Da1(20 mg/L)和 T1(50 μg/L)引起 SGC-7901細(xì)胞凋亡率顯著增加，與對照組及單獨用藥組抑制率相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01，見圖2，表3。

2.5 Da和TRAIL對SGC-7901增殖細(xì)胞周期的影響 SGC-7901細(xì)胞藥物處理24小時后，單獨用藥和聯(lián)合用藥均能夠誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，G1峰前出現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的凋亡峰Sub-G1。與對照組比隨著Da與 TRAIL聯(lián)合作用的增強，使G0/G1和G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，S期細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P＜0.01)，表明兩者聯(lián)合作用使S期受到阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖，見圖3、表4。

圖1 Da和/或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×5 000)Fig.1 Effect of TRAIL and/or Da treatment on morphological changes of the SGC-7901 cells(×5 000)

表1 Da或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.1 Effects of Da or TRAIL on proliferation of SGC-7901 cells(±s，n=4)

表1 Da或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.1 Effects of Da or TRAIL on proliferation of SGC-7901 cells(±s，n=4)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01.

Groups 12 h 24 h 48 h 72 h Control 0.00 ±3.800 0.00 ±2.100 0.00 ±6.000 0.00 ±11.500 Da1 9.23 ±6.7101) 7.27 ±3.682 34.84 ±9.8682) 4.82 ±4.000 Da2 7.77 ±6.2401) 13.61 ±12.182 47.24 ±5.2492) 29.52 ±14.7242)Da3 25.86 ±10.0402) 37.21 ±15.5522) 59.18 ±6.4132) 53.41 ±14.3512)Da4 36.81 ±7.7262) 43.85 ±11.1572) 77.45 ±6.1362) 44.63 ±4.9422)T1 2.95 ±3.211 3.27 ±2.910 11.24 ±4.9042) 5.31 ±4.390 T2 11.54 ±11.915 15.84 ±4.8612) 19.74 ±10.0932) 3.84 ±4.640 T3 16.43 ±6.8772) 26.70 ±9.9682) 38.53 ±6.6262) 28.56 ±6.0842)T4 33.72 ±9.3002) 41.92 ±5.3712) 48.61 ±7.1672) 34.47 ±11.3822)

表2 Da1聯(lián)合TRAIL對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.2 Effects of combination of TRAIL and Da1 on proliferation of SGC-7901 cells(±s，n=4)

表2 Da1聯(lián)合TRAIL對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.2 Effects of combination of TRAIL and Da1 on proliferation of SGC-7901 cells(±s，n=4)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01;Compared with T1，5)P ＜0.01.

Groups 24 h 48 h Control --- ---Da1(20 mg/L) 9.40 ±5.4011) 22.32 ±11.1122)T1(50 μg/L) 12.40 ±8.5921) 25.33 ±3.1072)Da1+T1 37.70 ±10.3142)4)5) 46.60 ±8.0062)3)5)

表3 Da和/或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 (±s，n=4)Tab.3 Effects of TRAIL and/or Da on apoptosis of SGC-7901 cells(±s，n=4)

表3 Da和/或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 (±s，n=4)Tab.3 Effects of TRAIL and/or Da on apoptosis of SGC-7901 cells(±s，n=4)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01;Compared with Da1，2)P ＜0.01.

051 Da1(20 mg/L)0.705 ±0.1111) 0.610 ±0.0831) 1.315 ±0.1461)T1(50 μg/L)2.500 ±0.2451) 4.896 ±0.6101) 7.396 ±0.3921)Da1+T1 4.157 ±0.7231)2)8.857 ±0.8151)2)13.013 ±1.4361)2)poptosis Control 0.247 ±0.037 0.417 ±0.030 0.664 ±0.Groups Early apoptosis Late apoptosis Total a

圖2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡Fig.2 Detection of apoptosis using Annexin V-FITC/PI double staining

圖3 Da和/或TRAIL對SGC-7901增殖細(xì)胞周期的作用Fig.3 Effects of TRAIL and/or Da on cell cycle of SGC-7901 cells

2.6 Da和 TRAIL對SGC-7901細(xì)胞凋亡中Bcl-2、survivin、caspase-3表達(dá)的影響 與對照組比，Da1聯(lián)合T1能夠下調(diào)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)，聯(lián)合用藥組與對照組比較，明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01，見圖4、表5。

表4 Da和/或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞周期的影響(±s，n=4)Tab.4 Effects of TRAIL and Da on cell cycle of SGC-7901 cells(±s，n=4)

表4 Da和/或TRAIL對SGC-7901細(xì)胞周期的影響(±s，n=4)Tab.4 Effects of TRAIL and Da on cell cycle of SGC-7901 cells(±s，n=4)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01.

Groups G0/G1 S G2/M Control 64.56 ±15.00 9.33 ±1.57 26.63 ±1.74 Da1(20 mg/L)64.29 ±9.03 10.08 ±1.89 25.09 ±2.34 T1(50 μg/L)62.75 ±12.07 16.03 ±2.542) 27.48 ±2.10 Da1+T1 59.96 ±4.99 19.35 ±2.032) 28.99 ±2.001)

圖4 凋亡蛋白caspase-3、survivin、Bcl-2表達(dá)變化Fig.4 Expression changes of apoptosis related protein caspase-3，Bcl-2 and survivin

表5 Da和/或 TRAIL對 caspase-3，survivin，Bcl-2表達(dá)的影響(±s，n=4)Tab.5 Effect of TRAIL and Da on the expressions of caspase-3，survivin，Bcl-2(±s，n=4)

表5 Da和/或 TRAIL對 caspase-3，survivin，Bcl-2表達(dá)的影響(±s，n=4)Tab.5 Effect of TRAIL and Da on the expressions of caspase-3，survivin，Bcl-2(±s，n=4)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with Da1，3)P ＜0.01;Compared with T1，4)P ＜0.01.

Groups caspase-3 survivin Bcl-2 Control 0.15 ±0.057 0.85 ±0.072 0.84 ±0.153 Da1(20 mg/L)0.20 ±0.045 0.73 ±0.120 0.77 ±0.156 T1(50 μg/L) 0.25 ±0.063 0.60 ±0.0692) 0.57 ±0.1161)Da1+T1 0.38 ±0.0282)3)4)0.42 ±0.0652)3)4)0.42 ±0.0862)3)4)

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，五年生存率僅為15%～20%，傳統(tǒng)化療是胃癌治療的一個重要手段，然而大劑量的化療藥物對機體組織可造成相當(dāng)?shù)亩靖弊饔茫绻撬枰种频?，加之常?guī)的化療效果也不甚理想［4］。有研究表明，增強 caspase-3、Bax基因或抑制survivin、Bcl-2基因的表達(dá)能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，明顯增強化療和放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［5，6］。

Da又名黃豆甙元，是存在于大豆中的一類重要的非營養(yǎng)成分，主要來源于大豆和齒狀植物等天然的食物中，相關(guān)研究認(rèn)為異黃酮類化合物在預(yù)防、治療惡性腫瘤以及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要作用［7］。Da通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)和線粒體途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，特別是通過誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比例的變化和激活 caspases-7和 caspases-9。TRAIL能通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，能夠迅速使表達(dá)TRAIL特異性受體通過多種信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對正常的細(xì)胞無毒性，被認(rèn)為是最理想的抗腫瘤新藥之一［8，9］。

本實驗結(jié)合MTT和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，觀察Da和TRAIL單獨及聯(lián)合對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的Da和TRAIL均能抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，且這種作用呈劑量依賴性，證實了兩者聯(lián)合使用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用增強并提高TRAIL對SGC-7901細(xì)胞敏感性。

本研究通過Western blot檢測Da、TRAIL誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，Da和TRAIL單獨用藥能夠下調(diào)Bcl-2、survivin表達(dá)，Da與TRAIL聯(lián)合作用顯著強于單獨用藥組。說明抑制胃癌細(xì)胞 Bcl-2、survivin的表達(dá)并增強caspase-3的表達(dá)有助于提高胃癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)Da不僅單獨應(yīng)用對胃癌SGC-7901細(xì)胞具有抑制增殖作用，而且與TRAIL聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高TRAIL的抗腫瘤活性，對誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。Da聯(lián)合TRAIL誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，其機制可能與細(xì)胞周期S期阻滯、下調(diào)Bcl-2、survivin蛋白及增強caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)，其深層次的作用機制仍需進一步的研究。

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