章 俊 劉贊朝

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科，貴陽(yáng)550004)

化療藥物依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物，臨床上廣泛用于治療急性粒細(xì)胞白血病、肺癌等惡性腫瘤［1］。研究表明，依托泊苷為細(xì)胞周期特異性藥物，它可與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合，干擾DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能，使DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的瞬間鏈的斷裂難以修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［2，3］。盡管VP-16對(duì)于多數(shù)腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，但其不良反應(yīng)(骨髓抑制，消化道反應(yīng)等)較多，限制了它的臨床應(yīng)用，因此探索影響其腫瘤作用的各種相關(guān)因素具有十分重要的意義。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］存在于多數(shù)真核細(xì)胞中，是當(dāng)今腫瘤基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，此酶通過(guò)將ADP-核糖單元從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)轉(zhuǎn)移至各種受體蛋白的谷氨酸殘基上，在DNA的堿基切除修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。鑒于此，在腫瘤的臨床治療上產(chǎn)生了一種圍繞PARP的治療策略:PARP抑制劑與DNA損傷類化療藥物聯(lián)用以抑制由PARP介導(dǎo)的DNA修復(fù)，從而增強(qiáng)腫瘤治療效果，并通過(guò)減少用藥(或放射)劑量以降低毒副作用［5，6］。臨床試驗(yàn)表明該類藥物毒副作用小、效果明確且短期耐受性良好，對(duì)于癌癥治療前景廣闊。

肺癌是我國(guó)常見的腫瘤之一，80%以上為非小細(xì)胞肺癌，而這些患者中約50%在診斷時(shí)已屬晚期，加之老年患者合并心肺功能疾病，不能耐受手術(shù)，所以化療是這類癌癥患者的主要治療措施，而效果良好和毒副反應(yīng)小的藥物(或藥物聯(lián)用)是我們的首選。ABT-888是一種強(qiáng)有效的PARP抑制劑，是第三代PARP抑制劑的代表。有研究證實(shí)，ABT-888單獨(dú)使用時(shí)即可降低肺癌細(xì)胞株H460中克隆基因的存活率，且能夠抑制DNA損傷的修復(fù);與替莫唑胺聯(lián)用時(shí)，則可顯著增強(qiáng)后者的抗癌活性［7，8］。本研究擬探討ABT-888與肺癌常用化療藥VP-16聯(lián)用對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的增殖與凋亡的影響，并通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)和Western blot技術(shù)觀察細(xì)胞DNA損傷水平及線粒體凋亡蛋白細(xì)胞色素c釋放的，以初步探討二者聯(lián)用的可能機(jī)制，為肺癌的臨床治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。依托泊苷為Sigma公司產(chǎn)品。ABT-888為Selleck公司產(chǎn)品。線粒體蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自杭州聯(lián)科生物公司。四甲基氮唑藍(lán)(methylthiaLzolyItetraLzolium，MTT)購(gòu)自Sigma公司。β-actin一抗、細(xì)胞色素c一抗和二抗均購(gòu)于南京巴傲得公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備懸液，以3.0 ×103個(gè)細(xì)胞(100 μl)接種于 96 孔板，24小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。依托泊苷(VP-16)濃度參考本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及國(guó)內(nèi)其他文獻(xiàn)報(bào)道，選用5 μg/ml。細(xì)胞隨機(jī)分成5組:①對(duì)照組(不加任何處理);②VP-16處理組(5 μg/ml VP-16處理);③VP16+5 μmol/L ABT-888 處理組 (5 μg/ml VP16+5 μmol/L ABT-888 聯(lián)合處理);④VP16+10 μmol/L ABT-888 處理組 (5 μg/ml VP16+10 μmol/L ABT-888聯(lián)合處理);⑤VP16+20 μmol/L ABT-888處理組 (5 μg/ml VP16+20 μmol/L ABT-888 聯(lián)合處理)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，孵育24小時(shí)后，每孔加入6 mg/ml的 MTT 20 μl，37℃孵育4 小時(shí)，棄上清，加入150 μl二甲基亞砜溶解結(jié)晶，測(cè)定570 nm處的吸光度 OD 值。細(xì)胞增殖率 =［實(shí)驗(yàn)組 OD值/對(duì)照組 OD值×100%］。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液，以5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，24小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按1.2.2方法處理細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，制備5.0×106ml－1單細(xì)胞懸液，取100 μl懸液，加入400 μl 1 ×Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI混勻，室溫避光孵育15分鐘后，由專業(yè)技術(shù)人員上機(jī)檢測(cè)。其中，存活細(xì)胞位于左下象限，早期凋亡細(xì)胞集中在右下象限，晚期凋亡細(xì)胞集中在右上象限，壞死細(xì)胞位于左上象限［9］。

1.2.4 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液，以3×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，24小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按1.2.2方法處理細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［10］方法，制備懸液，采用三層凝膠法制片，經(jīng)裂解、電泳后，碘化丙啶(PI)染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞彗星形態(tài)，每個(gè)濃度制備3張平行片子，每張片子統(tǒng)計(jì)100個(gè)彗星樣細(xì)胞，通過(guò)CASP彗星圖像分析軟件計(jì)算彗星圖像的頭部DNA百分率、尾部DNA百分率、尾矩和Olive尾矩，其中，Olive尾矩是DNA損傷的綜合指標(biāo)，本研究選擇Olive尾矩作為評(píng)價(jià)細(xì)胞DNA損傷程度的指標(biāo)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞線粒體和胞漿中細(xì)胞色素c蛋白水平 線粒體蛋白提取及蛋白定量按試劑盒說(shuō)明書操作。15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳2.5小時(shí)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，一抗4℃孵育過(guò)夜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1小時(shí)，ECL化學(xué)發(fā)光，采用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白水平變化，用圖像分析軟件(Image Pro.Plus 4.5)對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)結(jié)果 如圖1所示，A549細(xì)胞處理24小時(shí)后，各組增殖率均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);ABT-888濃度為5 μmol/L時(shí)與 VP-16(5 μg/ml)共同處理對(duì)A549細(xì)胞增殖率的抑制作用較VP-16單獨(dú)作用稍強(qiáng)，且差異有顯著性(P＜0.05);當(dāng)ABT-888 濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)與VP-16(5 μg/ml)共同處理對(duì)A549細(xì)胞增殖率的抑制作用較VP-16單獨(dú)作用時(shí)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 如圖2所示，A549細(xì)胞處理24小時(shí)后，各組細(xì)胞以早期凋亡為主，且早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);當(dāng)ABT-888與VP-16聯(lián)用時(shí)，伴隨ABT-888濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量百分比隨之增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，且兩種形式凋亡的細(xì)胞數(shù)量百分比均比VP-16單獨(dú)作用顯著升高(P ＜0.05)。

2.3 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 如圖3所示，A549細(xì)胞處理24小時(shí)后，各組細(xì)胞DNA損傷程度相比于對(duì)照組均顯著增加(P＜0.01);ABT-888與VP-16聯(lián)合處理時(shí)，伴隨ABT-888濃度的增加，細(xì)胞DNA損傷程度隨之加重，呈量效關(guān)系，且各聯(lián)合處理組細(xì)胞DNA損傷程度均比VP-16單獨(dú)處理組明顯升高(P ＜0.05)。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果 如圖4所示，A549細(xì)胞被處理24小時(shí)后，各組細(xì)胞線粒體中cytochrome c水平顯著降低，而胞漿中cytochrome c水平則顯著升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)ABT-888與VP-16聯(lián)用時(shí)，除(VP-16+5μmol/L ABT-888)組外，其余聯(lián)合處理組線粒體的 cyto chrome c均顯著低于VP-16單獨(dú)處理組(P＜0.05);所有聯(lián)合處理組細(xì)胞胞漿的cytochrome c均顯著高于VP-16單獨(dú)處理組(P＜0.01)。

圖1 MTT試驗(yàn)分析VP-16和ABT-888處理24小時(shí)后A549細(xì)胞增殖率的變化Fig.1 MTT assay analyse the cell proliferating ratio of A549 cells after treatment with VP-16 and/or ABT-888 for 24 h

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析VP-16和ABT-888處理24小時(shí)后A549細(xì)胞凋亡率的變化Fig.2 Flow cytometer analyses the apoptotic ratio of A549 cells after treatment with VP-16 and/or ABT-888 for 24 h

圖3 彗星實(shí)驗(yàn)分析VP-16和ABT-888處理24小時(shí)后A549細(xì)胞DNA損傷程度變化Fig.3 Comet assay analyse the DNA damage content in A549 cells after treatment with VP-16 and/or ABT-888 for 24 h

圖4 Western blot分析經(jīng)VP-16和ABT-888處理24小時(shí)后A549細(xì)胞中cytochrome c在線粒體和胞漿中的分布變化Fig.4 The distribution of cytochrome c in mitochondria and cytoplasm of A549 cells after treatment with VP-16 and/or ABT-888 for 24 h analysed by Western blot

3 討論

PARP是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的一種細(xì)胞核酶，在DNA修復(fù)和凋亡中發(fā)揮重要的作用。PARP家族有18個(gè)亞型，其中PARP-1占比例最大，發(fā)揮著90%以上的功能，在介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、消耗細(xì)胞能量池從而導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙和壞死、促進(jìn)炎癥基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮了重要作用［4］。PARP-1的缺失可使腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷因子易感，這可能與某些腫瘤的發(fā)生有關(guān)［11］，同時(shí)，抑制PARP-1可以減少DNA的修復(fù)效率，增強(qiáng)腫瘤化療效果［12］。Nozaki等［13］給予誘癌劑處理，PARP－/－小鼠結(jié)腸腺瘤和腺癌、肝臟結(jié)節(jié)發(fā)生率均明顯高于正常對(duì)照組(PARP+/+)，提示PARP-1表達(dá)的缺失與結(jié)腸腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Nomura等［14］發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中PARP-1蛋白表達(dá)量明顯高于鄰近非腫瘤組織，提示PARP-1在肝癌組織中的高表達(dá)可能與某些肝癌細(xì)胞的耐藥有關(guān)。ABT-888(veliparib)是由Abbott開發(fā)的一種強(qiáng)效PARP-1抑制劑，它與替莫唑胺、順鉑、環(huán)磷酰胺具有廣譜協(xié)同作用且耐受性良好，其聯(lián)合放療也能明顯提升對(duì)腫瘤的殺傷作用［4］。通過(guò)口服，其在小鼠、貓、犬體內(nèi)的生物利用度分別達(dá)92%、61%和72%［15］。目前ABT-888與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療人類腫瘤的研究也陸續(xù)進(jìn)入了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床階段。

本研究探討ABT-888對(duì)VP-16誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明:相對(duì)于對(duì)照組，VP-16組和VP-16與ABT-888聯(lián)用組細(xì)胞死亡率顯著升高;同時(shí)，VP-16與ABT-888聯(lián)用組細(xì)胞死亡率亦明顯高于VP-16單獨(dú)作用組，且有明顯的量效關(guān)系，這提示在本實(shí)驗(yàn)體系中，ABT-888的使用增強(qiáng)了A549細(xì)胞對(duì)化療藥物VP-16的藥敏作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VP-16組和VP-16與ABT-888聯(lián)用組細(xì)胞DNA損傷均較對(duì)照組顯著加重，且聯(lián)用組的DNA損傷水平卻明顯高于VP-16單獨(dú)使用組;Western blot結(jié)果則反映出VP-16與ABT-888聯(lián)用組細(xì)胞中線粒體細(xì)胞色素c的釋放明顯多于對(duì)照組和VP-16單獨(dú)使用組，由于細(xì)胞色素c的釋放是線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵事件，因此，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)中，ABT-888通過(guò)抑制PARP活性阻礙了VP-16誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)了后者對(duì)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)，相關(guān)分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，在5～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)的ABT-888可顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞株A549對(duì)VP-16的藥敏作用，為今后肺癌的藥物治療研究提供了一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。

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