孫明君，陳雍碩，鄭小龍，陳啟

（1.山東出入境檢驗檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，山東 青島 266002；2.GE Healthcare，上海 200000；3.浙江省疾控中心理化分析中心，浙江 杭州 310027）

葉酸是維持人體正常機能與代謝活動不可或缺的水溶性B族維生素，人體無法自行制造合成，必須額外補充。奶粉作為嬰幼兒主要食品，其中葉酸的含量對嬰兒健康的影響尤為重要。國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限制了奶粉中葉酸的添加量，但仍有不少市售奶粉存在葉酸的不合理添加。世界上許多國家和組織對奶粉中葉酸含量的檢測建立了限制標(biāo)準(zhǔn)，例如AOAC OfficialMethod 992.05 Total Folate（Pteroylglutamic Acid）in Infant Formula Microbiological Methods First Action 1992 Final Action 1995。截至2010年，奶粉中葉酸主要檢測方法有微生物檢測法，理化檢測法如HPLC和免疫檢測法，這些方法樣品前處理較為復(fù)雜，檢測時間較長。

基于表面等離子體共振（SPR）技術(shù)的生物傳感器是近年來發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，具有實時監(jiān)測分子間的相互作用、無需標(biāo)記、定量準(zhǔn)確等特點，已被廣泛應(yīng)用于藥物研究[1-2]、食品分析[3-4]、環(huán)境監(jiān)測[5-6]等領(lǐng)域。20世紀(jì)90年代瑞典的Biacore公司將SPR生物傳感器技術(shù)引入獸藥殘留分析中，截至21世紀(jì)10年代已生產(chǎn)出多種檢測試劑盒。國內(nèi)已有利用SPR技術(shù)進行牛奶中磺胺甲惡唑檢測研究[7]的報道。該技術(shù)的檢測方法，具有樣品前處理相對簡單、高特異性、分析快捷、定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢[8]。本研究利用SPR技術(shù)，建立奶粉中葉酸的檢測方法。該方法簡單、快捷、靈敏度高，重復(fù)性好，適用于大規(guī)模的奶粉中葉酸的含量檢測。

本實驗基于Biacore 3000型表面等離子共振儀，采用競爭抑制法作為檢測方法，測定嬰幼兒配方奶粉中的葉酸含量。在奶粉樣品中加入已知濃度的葉酸結(jié)合蛋白（folic acid binding protein，F(xiàn)ABP），混合后的樣品被流過預(yù)先包被過葉酸分子的傳感芯片。樣品中的葉酸分子會和FABP進行結(jié)合，而剩余的游離FABP則結(jié)合到芯片表面上的葉酸分子，因結(jié)合而產(chǎn)生的信號由儀器實時記錄并輸出。如果樣品中的葉酸分子濃度越高，則游離的FABP越少，產(chǎn)生的信號也相對較低，反之亦然。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

奶粉（市售）；葉酸傳感芯片（GE Healthcare）；葉酸結(jié)合蛋白（GE Healthcare）；超純水、Pall 0.22μm 濾膜；1 mL一次性無菌注射器；離心管（1.5、2、50 mL）；100 mL棕色容量瓶；96孔板（圓底）；BT224S天平：Sartorius；PICO17離心機：Thermo；Biacore3000型表面等離子體共振儀：GE Healthcare；MLS-3750 高溫滅菌鍋：SANYO。

1.2 樣品的前處理

精確稱取1g奶粉樣品到50mL離心管中，加35mL超純水，振蕩至完全溶解后于高溫滅菌鍋中105℃10 min（使樣品中蛋白質(zhì)失活）。取出冷卻至室溫，用超純水將體積補到40mL，再用移液槍吸2mL樣液至2mL離心管中，13000 r/min離心10 min，用1 mL一次性無菌注射器吸取1 mL中間的溶液部分（小心避開表層的脂肪層和底部的沉淀）過0.22μm濾膜到1.5 mL離心管中。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

用去離子水將標(biāo)準(zhǔn)樣品母液（100μg/mL）稀釋為1.23、3.70、11.1、33.3、80.0ng/mL。

該方法葉酸檢測范圍在2.0ng/mL～70ng/mL，最佳檢測范圍在10ng/mL～50ng/mL之間。

1.4 優(yōu)化芯片和再生試劑

將葉酸傳感芯片放入設(shè)備。緩沖液使用HBS-EP（0.01mol/LHEPES、0.15mol/LNaCl、3mmol/LEDTA、0.005%Surfactantp20），流速40μL/min。然后將50mmol/L氫氧化鈉注射入系統(tǒng)，每次60 s，連續(xù)進樣3次。再生試劑為50mmol/L氫氧化鈉，流速40μL/min，進樣時間30s。

1.5 樣品檢測

將樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品按照編輯好的程序并對應(yīng)樣品位置和體積用移液槍加樣。加完樣品后用鋁箔條封蓋96孔板，并放入儀器樣品盤中。在1.5 mL離心管中分別加入對應(yīng)體積的葉酸結(jié)合蛋白和再生試劑，并放入樣品盤中，保存文件后，點擊開始進行檢測。

1.6 回收率試驗

從10個檢測樣品中隨機選取3個樣品，每個樣品加標(biāo)量20ng/mL，做回收率試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 再生條件的優(yōu)化與芯片穩(wěn)定性

采用甘氨酸、氫氧化鈉以及氯化鈉等試劑進行再生條件篩選。最終確定50mmol/L氫氧化鈉，流速40μL/min，進樣30 s作為再生條件。

將葉酸結(jié)合蛋白按1∶100稀釋，進樣時間60 s，流速40μL/min。再生條件為50 mmol/L氫氧化鈉，流速40μL/mL，進樣30 s。依照進樣—再生的順序作為一個循環(huán)，共進行50個循環(huán)進行芯片穩(wěn)定性測試。結(jié)果如圖。從基線信號和結(jié)合信號的趨勢可以看出，每一次再生都可以將結(jié)合到芯片上的葉酸結(jié)合蛋白完全洗脫下，同時對蛋白的再次結(jié)合影響微乎其微。芯片穩(wěn)定性測試結(jié)果見圖1。

圖1 芯片穩(wěn)定性測試Fig.1 Stability test of chip

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)在不同濃度下得到的結(jié)合信號，采用四因子非線性回歸進行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

2.3 不同方法的樣品測定結(jié)果的比較

目前，國標(biāo)GB5413.16-2010《嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定》采用微生物法來測定嬰幼兒食品和乳品中的葉酸含量，所以我們使用商品化試劑盒（拜發(fā)公司）采用微生物微量滴定法來作方法比較。對市售10個奶粉分別做了生物傳感器與微生物法檢測葉酸的試驗，結(jié)果見表1。

圖2 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Calibration curve or folic acid

表1 兩種方法檢測葉酸的數(shù)據(jù)結(jié)果Table 1 Analyses of comparing the data of folic acid assay in two different methods

日內(nèi)精密度結(jié)果見表2。

表2 日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)（n=7）Table 2 Data of the intra-day precision

從試驗數(shù)據(jù)來看，生物傳感器方法所得結(jié)果與微生物法檢測結(jié)果基本一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，日內(nèi)精密度試驗所得結(jié)果也比較滿意。

2.4 回收率

樣品回收率結(jié)果見表3。

表3 樣品回收率數(shù)據(jù)Table 3 Data of sample recovery rate

從10個檢測樣品中隨機選取3個樣品，編號分別是3、6、8號，每個樣品加標(biāo)量20ng/mL，并按照樣品檢測步驟做回收率試驗。通過所檢測的數(shù)據(jù)，計算后得到3號樣品回收率為91.94%、6號樣品回收率為96.41%、8號樣品回收率為85.49%，結(jié)果在預(yù)期范圍之內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究通過對照奶粉中添加不同質(zhì)量濃度的葉酸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，與緩沖液[9]相比，更加合理，減少了奶粉樣品中其他物質(zhì)的影響，最低檢測質(zhì)量濃度為0.006μg/100 g。并且優(yōu)化了再生條件，提高了芯片的穩(wěn)定性。從10個樣品的檢測結(jié)果來看，與微生物法檢測結(jié)果基本一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，日內(nèi)精密度試驗RSD為2.59%，隨機選取的3個樣品回收率在85.49%～96.41%之間。樣品只需簡單的稀釋、離心處理即可直接檢測，可以實測奶粉樣品中的葉酸質(zhì)量濃度范圍為2.0ng/mL～70ng/mL。單個樣品測量用時9 min，可在4 h內(nèi)完成20個樣品的結(jié)檢測。相對傳統(tǒng)的HPLC和GC檢測技術(shù)，本方法樣品前處理簡單，同時也縮短了測量時間，是一種高效便捷的測量方法。

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