梁君妮，劉寧，曹鵬，孫磊麗，牟妍，關(guān)麗麗，李彥，沙美蘭，徐娟

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000；2.青島科技大學，山東青島264200）

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones），又稱吡啶酮酸類藥物，屬于化學合成抗菌藥。具有抗菌譜廣、殺菌力強、使用方便、不良反應(yīng)少等特點[1]。因此被廣泛用于治療小動物、禽類、家畜及水生動物由細菌、支原體引起的消化、呼吸、泌尿、生殖等系統(tǒng)疾病以及皮膚軟組織的感染性疾病[2-4]。但是該類藥物本身具有一定毒性，超劑量或長期反復(fù)使用該藥可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)等不良反應(yīng)[5]。隨著社會的發(fā)展和生活水平的不斷提高，食品安全問題愈來愈受到關(guān)注。飼料是動物的直接食品，它的安全與否直接關(guān)系到動物性食品的安全，飼料的不安全因素會通過食物鏈對人類的健康造成危害。人若長期食用含抗生素的畜禽產(chǎn)品，可產(chǎn)生耐藥性及其他不良反應(yīng)[6]。為了保障畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全和人類健康，已禁止喹諾酮類藥物作為藥物添加劑在商品飼料中添加[7]，但是濫用該類藥物的情況依然存在，必須從整個食物鏈的源頭--飼料抓起。因此建立一種同時檢測飼料中多種喹諾酮類藥物的方法具有重要意義。

目前飼料中氟喹諾酮類藥物檢測主要采用高效液相色譜法[8-10]、毛細管電泳法[11]和液質(zhì)聯(lián)用法[12-18]。高效液相色譜法分析時間長，定性能力差，假陽性率高。液質(zhì)聯(lián)用法是近幾年興起的新技術(shù)，與液相色譜法比較具有更高的靈敏度、選擇性。本研究用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測飼料中16 種氟喹諾酮類藥物，通過對前處理方法和質(zhì)譜方法等的研究，建立一種快速、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1200 型高效液相色譜、6410B 三重四級桿質(zhì)譜儀：美國Agilent 公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機：日本Hitachi 公司；Milli-Q 超純水：美國Millipore 公司；氮吹濃縮儀：美國Organomation Associates 公司；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI 公司；SB5200 型超聲波清洗機：SHANGHAI BRANSON；Oasis MCX 固相萃取小柱：美國Waters 公司。

標準品：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、麻保沙星、萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸、依諾沙星、洛美沙星、司帕沙星、奧比沙星，均購于Dr.Ehrenstorfer 公司，純度>95%，

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk 公司），乙酸、甲酸（色譜純，TEDIA），水為超純水。飼料均購于市場。

1.2 標準溶液的配置

1.2.1 16種喹諾酮類標準儲備液

精密稱取16 種氟喹諾酮類藥物，用30 mmol/L 氫氧化鈉溶解后移入100 mL 容量瓶中，并稀釋至刻度，配制成含量為100.0 mg/kg 的溶液。

1.2.2 標準中間液

將標準儲備液用30 mmol/L 氫氧化鈉稀釋成1.0 mg/kg。

1.2.3 標準使用液

將標準中間液用30 mmol/L 氫氧化鈉依次稀釋至100.0、50.0、20.0、10.0、5.0 μg/kg 的標準系列溶液，待用。

以上標準溶液均于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

準確稱取5.0 g 樣品，置于50 mL 離心管中，加入適量水浸泡1 h（保證飼料樣品完全潤濕），加入1%乙酸的乙腈溶液15 mL，超聲提取20 min，振蕩提取5 min，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液于雞心瓶中，重復(fù)上述提取步驟一次，合并上清液，40 ℃快速濃縮至干。向雞心瓶中加入1.0 mL 甲醇，渦混溶解殘渣，加入9 mL超純水，混合均勻，分取10 mL 作為上樣液，使用Oasis MCX 固相萃取柱進行凈化處理。依次用3 mL 甲醇及3 mL 超純水活化MCX 固相萃取柱，將提取液以不超過1.0 mL/min 的速度通過固相萃取柱，加入3 mL 水及3 mL 甲醇淋洗，抽干。5.0 mL 氨化甲醇（5%氨水）洗脫，洗脫液于40 ℃氮吹儀吹干，加入1.0 mL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（20 ∶80/體積比）溶解殘渣，過0.2 μm的濾膜，待測。

1.4 檢測方法

1.4.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B 為乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～5.00 min，10%B；5.00 min～8.00 min，20%B～90%B；8.00 min～9.00 min，90%B；9.01 min～12.00 min，90%B～10%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+），掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），Delta EMV：500 V，霧化氣壓力：35 psi，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：600 L/min，毛細管電壓：4 000 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 16 種喹諾酮類的質(zhì)譜條件Table 1 MS/MS conditions of 16 Quinolones

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

2.1.1 提取方法的優(yōu)化

本方法的基質(zhì)飼料吸濕性很強，如果直接用提取溶劑提取，會造成大量損失，回收率大大下降。乙酸的加入是沉淀蛋白。本方法通過對提取溶劑種類、乙酸添加的比例、提取方法、提取液用量、提取時間等因素對提取效果影響的考察，發(fā)現(xiàn)在樣品中加入適量水浸泡，加入1%乙酸的乙腈溶液15 mL，超聲提取20 min，振蕩提取5 min，重復(fù)提取兩次，提取效果較好。

2.1.2 凈化方法的優(yōu)化

由于飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，如果采用正己烷凈化效果較差，所以選擇SPE 固相萃取柱對樣品進行凈化處理[19]?？疾炝薕asis HLB、堿性氧化鋁、Oasis MCX 柱3 種固相萃取柱及淋洗液、洗脫液種類、洗脫液體積等對回收率和凈化效果的影響。實驗結(jié)果表明，Oasis MCX效果最好，每種藥物均能獲得較高的回收率，且能很好的去除雜質(zhì)干擾，見圖1。因此最終選擇Oasis MCX柱進行凈化。

圖1 不同凈化柱對回收率的影響Fig.1 Effects on the recoveries of 16 quinolones with different columns

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關(guān)系

用16 種氟喹諾酮類混合標準工作液，分別為100.0、50.0、20.0、10.0、5.0 μg/kg，按上述色譜和質(zhì)譜條件測定其峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg/kg）為橫坐標，峰面積的比值Y 為縱坐標，繪制16 種氟喹諾酮類混合標準溶液工作曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。

表2 16 種氟喹諾酮類藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Equations of linear regression and correlation coefficients of 16 veterinary quinolones

結(jié)果表明，16 種氟喹諾酮類藥物濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍：5.0 μg/kg～100.0 μg/kg。

2.2.2 檢測低限

按所建立的色譜條件，以3 倍噪音比作為檢測低限，測得本方法16 種氟喹諾酮類藥物的測定低限均可以達到10.0 μg/kg，滿足國內(nèi)和國際對喹諾酮類藥物殘留監(jiān)控的要求。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的消除

由于空白樣品基質(zhì)溶液對16 種氟喹諾酮類標準物質(zhì)有不同程度的影響，本文采用配制基質(zhì)匹配標準溶液用于定量的方法，很好的消除了基質(zhì)影響，完全能滿足殘留檢測的要求。

2.2.4 方法的靈敏度和精確度

以空白飼料為樣品，制備添加10.0、20.0、100.0 μg/kg 3 個水平的16 種氟喹諾酮類藥物混標，制成模擬加標樣品，按上述實驗方法進行測定，每個添加水平重復(fù)測定6 個樣品，同時做空白對照。所得到的樣品中各待測組分的添加回收率均70.7%～86.4%之間，相對標準偏差3.8%～9.2%，方法準確度及精密度滿足要求。

保留時間（min）：恩諾沙星（7.125）、環(huán)丙沙星（6.307）、氧氟沙星（6.038）、諾氟沙星（6.039）、培氟沙星（6.220）、二氟沙星（7.757）、丹諾沙星（10.612）、沙拉沙星（7.718）、麻保沙星（8.961）、萘啶酸（8.896）、氟甲喹（8.481）、惡喹酸（8.481）、依諾沙星（5.662）、洛美沙星（5.535）、司帕沙星（4.090）、奧比沙星（7.261）。

飼料添加濃度為10.0 μg/kg 的樣品的LC-MS/MS TIC 圖和部分選擇離子流圖譜圖見圖2 和圖3。

圖2 TIC 圖Fig.2 Total iron chromatograms

3 結(jié)論

圖3 添加10.0 μg/kg 16 種氟喹諾酮類飼料樣品的部分選擇離子流圖Fig.3 Some selected ion chromatograms of 16 quinolones in the feed adding 10.0 μg/kg

建立了飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、麻保沙星、萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸、依諾沙星、洛美沙星、司帕沙星、奧比沙星16 種氟喹諾酮類殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。試樣用水浸泡1 h，1%乙酸的乙腈溶液提取，Oasis MCX 固相萃取柱凈化，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，HPLC-MS/MS 法檢測，同時定性、定量測定16 種氟喹諾酮類抗生素殘留。16 種氟喹諾酮類抗生素在色譜柱上分離效果較好，回收率在70.7%～86.4%之間，相對標準偏差在3.8%～9.2%之間，均能滿足獸藥殘留分析的要求，方法準確、簡便、快速，為飼料中多種獸藥殘留測定提供了可靠的前處理方法和檢測手段。

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