劉潤珠，王松，崔鶴，高建國，張靖坤，張文皓

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品中心，山東青島266002；2.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266001；3.美國賽默飛世爾科技中國公司，山東青島266032）

由于長期大量使用與濫用，農(nóng)藥已成為食品的重要污染源之一，特別是隨著我國人民生活水平的提高，肉、水產(chǎn)品、蛋、乳類等動(dòng)物源性食品在居民膳食結(jié)構(gòu)中所占的比例越來越大。通過環(huán)境接觸、食物鏈富集等進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的農(nóng)藥殘留問題成為了關(guān)注熱點(diǎn)[1-6]。

近年來我國在蔬果、茶葉等植物源性食品及水體、土壤等環(huán)境中的農(nóng)殘檢測上已取得了較大進(jìn)展，但針對(duì)動(dòng)物源性食品農(nóng)藥殘留檢測，尤其是同時(shí)測定不同類型農(nóng)藥殘留的多殘留檢測則較少研究，檢測技術(shù)上的差距還導(dǎo)致我國出口動(dòng)物源性食品遭遇歐美日等發(fā)達(dá)國家的技術(shù)性貿(mào)易壁壘。因此，提高我國動(dòng)物源性食品農(nóng)藥多殘留檢測水平，顯得十分重要和緊迫[7]。

凝膠滲透色譜法（gel-permeation chromatograph，GPC）是一項(xiàng)成熟的農(nóng)藥殘留凈化技術(shù)[8]，其主要原理是根據(jù)不同體積的分子在凝膠色譜柱保留的時(shí)間差異，來分離目標(biāo)物。針對(duì)動(dòng)物源樣品中動(dòng)物源樣品中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸類物質(zhì)，能把農(nóng)藥殘留從各種復(fù)雜基質(zhì)中分離出來，但同時(shí)有些近似分子量的干擾物可能會(huì)被夾帶洗脫，不能達(dá)到完全凈化，因此有時(shí)需要與其他技術(shù)連用，做進(jìn)一步凈化。我們以乙腈為溶劑，將動(dòng)物源樣品均質(zhì)提取，提取液用GPC 除去脂類、蛋白質(zhì)和大部分大分子雜質(zhì)[9]，再經(jīng)SAX/PSA 固相萃取[10]，進(jìn)一步除去樣品中可能含有的有機(jī)酸等極性雜質(zhì)，此方法可以實(shí)現(xiàn)樣品的無擾動(dòng)分析，能夠大幅提高萃取效率，可以使檢測儀器的靈敏度提高。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

QP2010plus 氣相色譜-質(zhì)譜儀：島津，配EI 源和自動(dòng)進(jìn)樣器；T25 型均質(zhì)器：IKA；39760 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：Thermolyne 公司；5810R 型離心機(jī)：Eppendorf 公司；凝膠色譜儀：L2，配有單元泵、餾分收集器。

30%丙酮/正己烷溶液（取300mL 丙酮，加入700mL正己烷，搖勻備用）；50%丙酮/正己烷溶液（取500 mL丙酮，加入500 mL 正己烷，搖勻備用）；50%環(huán)己烷/乙酸乙酯（取500 mL 環(huán)己烷和500 mL 正己烷，搖勻備用）；含500 ng 菲氘體的轉(zhuǎn)溶液（取0.5 mL 的1 000 μg/mL菲氘體溶液加入500 mL 丙酮，500 mL 正己烷，搖勻備用）；NaCl 飽和2 mmol/L 磷酸緩沖溶液（量取1000 mL純水，攪拌下加入210 g 磷酸氫二鉀、120 g 磷酸二氫鉀和200 gNaCl 至固體完全溶解，用NaOH 溶液調(diào)pH至7.5）；單標(biāo)儲(chǔ)備液（分別稱取10 mg～20 mg 農(nóng)藥各標(biāo)準(zhǔn)物分別于10 mL 容量瓶中，用丙酮或乙腈定容至刻度，置于-18 ℃以下冷凍保存）；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（分別準(zhǔn)確移取各種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用丙酮配制成濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液，置于-18℃以下冷凍保存）。

1.2 方法

1.2.1 提取

稱取10 g 試樣（精確至0.01 g）于250 mL 燒杯中，加入乙腈40 mL、純水10 mL，棒狀均質(zhì)器約10 000 r/min下均質(zhì)提取2 min，然后抽濾（若不能順利濾下，可在樣品中加1 g～2 g 硅藻土），用15 mL 乙腈分兩次清洗均質(zhì)杯，并入接收瓶。將提取溶液調(diào)pH 至中性，然后轉(zhuǎn)入已盛有NaCl 的分液漏斗中，少量乙腈沖洗燒杯，振蕩3 min，靜置10 min。棄去水層，取乙腈層于蒸餾瓶內(nèi)，乙腈沖洗蒸餾瓶瓶口，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40 ℃下減壓濃縮至干。加入10 mL50%環(huán)己烷/乙酸乙酯溶解殘?jiān)?，?.45 μm 濾膜過濾，待凝膠色譜（GPC）凈化。

1.2.2 凝膠色譜（GPC）凈化

凝膠凈化柱：Bio Beads S-X3 7 mm×250 mm；流動(dòng)相：50%環(huán)己烷/乙酸乙酯；流速：4.7 mL/min；樣品定量環(huán)：10 mL；預(yù)淋洗時(shí)間：10 min；凝膠色譜平衡時(shí)間：5 min；收集時(shí)間：23 min～31 min。將10 mL 待凈化液進(jìn)行凈化，收集23 min～31 min 區(qū)間的組分，于40 ℃下濃縮至近干，待固相萃取凈化。

1.2.3 固相萃取（SPE）凈化

SAX/PSA 柱預(yù)先用30 %的丙酮/正己烷溶液（5 mL×2）平衡，3 mL 30%的丙酮/正己烷溶液加入蒸餾瓶內(nèi)，移入柱內(nèi)，50 mL 蒸餾瓶接收，使用30 mL 30%丙酮/正己烷沖洗蒸餾瓶，并移入SAX/PSA 柱進(jìn)行洗脫接收，當(dāng)液面降至與填料齊平時(shí)，該流出液作為第一部分；再用50%的丙酮/正己烷溶液30 mL 洗脫，真空抽干，流出液作為第二部分。第一部分、第二部分分別使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃下減壓濃縮至近干，氮?dú)獯蹈桑院?00 ng 菲氘體的轉(zhuǎn)溶液定容2 mL 后，用于氣相色譜-質(zhì)譜測定。

1.2.4 儀器測定

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管柱或相當(dāng)者；色譜柱溫度：60 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min 程序升溫至150 ℃，再以2 ℃/min 升溫至220 ℃，再以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持9 min；載氣：氦氣，純度≥99.999 %，流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：無分流進(jìn)樣，2 min后開閥；電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：200 ℃；GCMS 接口溫度：280 ℃；選擇離子監(jiān)測：多離子監(jiān)測；溶劑延遲：8 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果分析

在確定的儀器條件下，50、100、200 μg/L 3 種濃度，三點(diǎn)線性相關(guān)系數(shù)均超過0.999，通過S/N=10 計(jì)算得儀器定量限在1.0 μg/kg～13.9 μg/kg，方法定量限為0.2 μg/kg～2.8 μg/kg，均小于10 μg/kg 的一律基準(zhǔn)要求，完全滿足大規(guī)模篩查的需要。

同時(shí)，通過對(duì)牛肉、豬肉兩種基體進(jìn)行50、100、200 μg/kg 3 種不同濃度的添加回收實(shí)驗(yàn)，回收率在65.1%～124.7%，由于測定項(xiàng)目較多，其中由于動(dòng)物源性基質(zhì)的成分較為復(fù)雜，雖通過GPC 與SPE 兩種凈化手段仍在部分農(nóng)藥測定方面存在很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，因此，檢測過程中使用了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量。

2.2 討論

2.2.1 提取溶劑的選擇

目前多農(nóng)殘分析中主要使用的提取溶劑為丙酮、乙腈和乙酸乙酯，其中丙酮與水良好的互溶性會(huì)在凈化過程中帶來一定的繁瑣；而乙酸乙酯對(duì)于非極性雜質(zhì)，特別是甾醇類等大分子雜質(zhì)的提取效率相對(duì)較高，因此目前主流的多農(nóng)藥殘留分析方法一般均采用乙腈作為提取溶劑。我們?cè)谶@個(gè)方法中也選擇了乙腈作為提取溶劑，取得了滿意的結(jié)果。提取過程中選擇

乙腈作為溶劑，加入水的主要目的是為了潤濕樣品，增加乙腈對(duì)肌肉的滲透性，可將肌肉組織分散的非常均勻，提高提取效率[11]。

表1 質(zhì)譜相關(guān)檢測參數(shù)Table1 Mass spectrometry detection parameters

2.2.2 凈化

2.2.2.1 SPE 凈化柱選擇

從SPE 柱的填料性質(zhì)分析，SAX/PSA 雙層小柱含有上層的SAX 和下層的PSA 兩種填料，綜合了SAX 和PSA 的優(yōu)勢，SAX 可吸附基質(zhì)中幾乎所有的酸性雜質(zhì)，PSA 可有效去除食品中的脂肪酸，有機(jī)酸、極性色素和糖類。由于動(dòng)物源基質(zhì)中經(jīng)過GPC 處理后，已經(jīng)去除大部分的大分子雜質(zhì)干擾，其余干擾物多為脂肪酸、有機(jī)酸類物質(zhì)，選用SAX/PSA 作為SPE 過程的凈化柱，能有效得去除干擾雜質(zhì)。

2.2.2.2 pH 調(diào)節(jié)

在液液分配過程中水相的pH 對(duì)于農(nóng)藥的回收率有著相當(dāng)大的影響：在酸性條件下，存在某些農(nóng)藥回收率較低的情況；而大部分有機(jī)磷農(nóng)藥在堿性條件下存在不穩(wěn)定性，為了保證在液液分配過程的穩(wěn)定性，因此在液液分配過程中需要使用緩沖溶液調(diào)整pH 到中性。

2.2.2.3 濃縮

在最后旋轉(zhuǎn)濃縮過程中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃縮的方式和程度對(duì)于易揮發(fā)組分尤其是DDVP 的回收率影響相當(dāng)大，氮吹至干的時(shí)候一般DDVP 的回收率都會(huì)低于30%，而使用旋轉(zhuǎn)濃縮的方式濃縮至近干的時(shí)候回收率會(huì)相對(duì)較好，特別是在濃縮前加入少量正十烷，一方面可以防止最后濃縮至近干時(shí)敵敵畏的損失，另一方面在氣相檢測的時(shí)候高沸點(diǎn)溶劑起到溶劑聚焦的作用有利于改善峰形。

3 結(jié)論

本方法針對(duì)于動(dòng)物源產(chǎn)品中經(jīng)常檢出的208 種農(nóng)藥，建立了凝膠色譜/固相萃取氣質(zhì)聯(lián)用檢測分析方法。本方法的凈化力度比較大，對(duì)于目前常見樣品，這個(gè)方法足以滿足日本肯定列表一律基準(zhǔn)的要求，但是綜合來講，這個(gè)方法的凈化步驟較多，凈化步驟越多，前處理過程中出現(xiàn)損失的可能就越多，因此對(duì)于這個(gè)方法的日常使用來講，人員操作的熟練程度和實(shí)驗(yàn)室整體質(zhì)量控制質(zhì)量保證手段決定了這個(gè)方法的實(shí)際應(yīng)用效果。另外，由于本方法包括的農(nóng)藥面比較寬，極性分布比較廣，有利于今后新農(nóng)藥品種的增減。

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