宋占春，王占勝，白靜慧，3，胡健

（1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110001；2.撫順市中心醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 撫順 113006；3.遼寧省腫瘤醫(yī)院ICU，沈陽110001）

心肌炎（myocarditis）是心臟的炎癥性疾病，是擴張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）的主要病因，并可導致青少年發(fā)生心力衰竭及猝死［1］。目前，心肌炎仍是心血管研究領(lǐng)域中一個具有挑戰(zhàn)性的臨床問題。心肌炎的具體發(fā)病機制仍未完全清楚，但越來越多的證據(jù)表明炎癥和免疫因素在心肌炎和DCM的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用［2］。因此，抗炎治療和免疫治療已經(jīng)成為近年來的研究熱點。大黃素長期以來一直被用于各種炎癥性疾病及腫瘤相關(guān)疾病的治療。以往的多項研究表明，大黃素（emodin）具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［3，4］。本研究觀察了大黃素對自身免疫性心肌炎（experimental au－toimmune myocarditis，EAM）大鼠細胞因子 IFN-γ 及IL-17的調(diào)節(jié)作用，旨在探討大黃素對EAM大鼠心肌的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：6周齡SPF級雄性Lewis大鼠24只（160～180 g），購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑及材料：豬心肌肌球蛋白（美國Sigma公司），弗氏完全佐劑（美國Sigma公司），二甲基亞砜（美國Sigma公司），大黃素（中國藥品生物制品檢定所，濃度＞98%），IFN-γ、IL-17 ELISA 試劑盒（美國Biosource公司），IFN-γ抗體（北京博奧森生物制劑有限公司），IL-17抗體（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組：Lewis大鼠24只隨機分為3組：實驗性自身免疫性心肌炎（EAM）組，大黃素（Emodin）組和對照（Control）組。參照文獻建立EAM模型［5］，將濃度為11.7 mg/mL的豬心肌球蛋白原液經(jīng)0.01 mol/L PBS稀釋成10 mg/mL的溶液后與等體積弗氏完全佐劑（含有結(jié)核分支桿菌H37Ra 1 mg/mL）混勻成乳濁液。實驗0 d及7 d，于EAM組及Emodin組大鼠的左右后肢足墊皮下各注射混合后的乳濁液0.1 mL（即每只大鼠共注射0.2 mL乳化液）；Control組用完全弗氏佐劑（等體積0.01 mol/L PBS與完全弗氏佐劑混合液）假性免疫。

1.2.2 給藥方式：大黃素以二甲基亞砜（美國Sigma公司）溶解后加蒸餾水制成3 mg/mL溶液，Emodin組大鼠于0 d起，每日給予50 mg/kg大黃素（中國藥品生物制品檢定所，濃度＞98%）空腹灌胃治療，共21 d。EAM組和Control組大鼠每日給予蒸餾水灌胃。21 d時處死大鼠，留取心肌組織及血清標本。

1.2.3 心肌組織病理學檢測：將心肌組織在10%甲醛溶液中固定后，經(jīng)過梯度乙醇脫水，浸蠟和包埋等步驟，制成石蠟塊，間斷切片，厚度5 μm。常規(guī)HE及Masson′s三聯(lián)染色，光學顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.4 ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-17的水平：大鼠采血后，靜置15～20 min，離心后（3 000 r/min，10 min）分離血清，ELISA法檢測血清IFN-γ、IL-17的水平。檢測嚴格按ELISA試劑盒說明書步驟進行。

1.2.5 Western blot法檢測心肌組織中IFN-γ、IL-17的水平：制備SDS-PAGE膠，心肌組織勻漿后取上清，40 μg（20 μL）上樣，電壓 70 V 電泳 1.5 h 后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育（稀釋比例1∶5 000）4℃過夜，HRP標記的二抗37℃孵育（稀釋比例1∶5 000）45 min，ECL顯色，暗室曝光，顯影后掃描其光密度值。GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

在實驗結(jié)束前，各組大鼠均無死亡。Control組大鼠精神狀態(tài)、活動及飲食均正常。EAM組大鼠從10 d開始陸續(xù)出現(xiàn)食欲下降，倦怠少動、毛發(fā)晦暗蓬松；Emodin組的大鼠也出現(xiàn)上述改變，但與EAM組相比癥狀有所減輕。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學結(jié)果

結(jié)果顯示，Control組未見炎性細胞浸潤（圖1A），EAM組可見大量的淋巴細胞、中性粒細胞及多核巨細胞浸潤（圖1B），Emondin組也可見炎性細胞浸潤，但浸潤程度較EAM組明顯減輕（圖1C）。Masson′s染色結(jié)果顯示，Control組無明顯心肌纖維化改變（圖2A），EAM組大鼠心肌纖維化改變較明顯（圖2B），而Emodin的干預減輕了纖維化的程度（圖2C）。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色×200Fig.1 HEstainingofMyocardialtissueineachgroupofrats×200

圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色×200Fig.2 Masson′s trichrome of myocardial tissue in each group×200

2.3 各組大鼠血清中IFN-γ和IL-17的水平

EAM組與Control相比，IFN-γ的濃度明顯升高［（168.83± 21.53）pg/mL vs（54.62 ±7.34）pg/mL，P ＜0.05）］，與 EAM 組相比，Emodin 組的 IFN-γ 的濃度明顯下降［（92.92± 7.36）pg/mL，P ＜ 0.05）］；EAM 組與Control相比，IL-17的也濃度也明顯升高［（69.50±7.57）pg/mL vs（20.72 ±4.36）pg/mL，P ＜ 0.05）］，與EAM組相比，Emodin組的IL-17的濃度也明顯下降［（34.44± 4.42）pg/mL，P ＜ 0.05）］，見圖3。

圖3 各組大鼠血清中IFN-γ和IL-17的水平Fig.3 Serum levels of IFN-γand IL-17 in each group

2.4 各組大鼠心肌組織中IFN-γ和IL-17蛋白的表達水平

為檢測大黃素能否影響心肌組織中IFN-γ和IL-17的蛋白表達，我們使用Western blot法檢測心肌組織中IFN-γ和IL-17的蛋白表達水平。以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白/GAPDH代表條帶強弱的相對值。結(jié)果示：IFN-γ和IL-17在Control組呈現(xiàn)低表達，而EAM組的表達水平顯著增高，兩者之間有顯著性差異（P＜0.05）；與EAM組相比較，Emodin組大鼠的心肌中的IFN-γ和IL-17蛋白表達水平顯著降低，組間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結(jié)果說明在EAM組的心肌中IFN-γ和IL-17蛋白的表達水平明顯升高，大黃素的干預抑制了它們的過度表達（圖4）。

3 討論

眾多研究證實，自身免疫反應在心肌炎的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，因此建立自身免疫性心肌炎的實驗模型對心肌炎發(fā)病機制的研究及藥物治療的評估等有著重要的意義。EAM的鼠模型可以作為代表人類心肌炎疾病的模型［6，7］，因其組織形態(tài)學與人類的心肌炎的急慢性期都很相似。EAM是T細胞介導的疾病，其心臟炎癥的高峰期在免疫后的21 d［8］，既往研究表明，EAM 主要是由 Thl細胞介導的免疫反應［9］，調(diào)節(jié)Thl/Th2的平衡可以減輕EAM［10，11］。然而近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Th17 是一種新的以分泌IL-17為特征的CD4+T細胞的新亞群。且有學者證實Th17和其產(chǎn)生的炎性介質(zhì)IL-17在EAM的發(fā)生發(fā)展中也起到了至關(guān)重要的作用［12，13］。

圖4 各組大鼠心肌組織中IFN-γ和IL-17的水平Fig.4 Myocardial tissue levels of IFN-γand IL-17 in each group

大黃素是一種羥基蒽醌類的衍生物。大黃素的分子式為C15H10O5，分子量是270.23。大黃素長期以來一直被用于炎癥性疾病的治療。目前多項研究表明，大黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，在臨床上具有廣闊的研究價值及應用前景。并且，大黃素還能夠抑制T細胞增殖，并可以調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡［3，4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，EAM組大鼠初次免疫后21 d，心肌HE及Masson′s染色結(jié)果提示心肌細胞排列紊亂，心肌組織炎性細胞浸潤及纖維化明顯，EAM組的這些改變與既往研究建立EAM模型的報道相似［14］，而大黃素的干預，明顯改善EAM大鼠心肌炎癥及纖維化程度。在本實驗我們還應用ELISA和Western blot技術(shù)，探討大黃素對EAM大鼠心臟的保護作用是否與其對Th17型細胞因子IL-17及Th1型細胞因子IFN-γ的抑制作用有關(guān)。結(jié)果顯示，EAM大鼠心肌組織及血清中細胞因子IFN-γ和IL-17的濃度均顯著升高，而Emodin的干預明顯降低了IL-17和IFN-γ的水平。這些研究結(jié)果表明，EAM的發(fā)病機制可能與Th1及Th17細胞亞群相關(guān)，這與既往的研究結(jié)果相似［13］。而大黃素可能是通過抑制IFN-γ、IL-17的水平而緩解了EAM大鼠的心臟炎癥改變。我們的研究表明大黃素可能對Th1及Th17細胞亞群具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，進而對EAM大鼠的心臟起到一定的保護作用，為炎癥相關(guān)性心血管疾病的臨床防治提供了新的藥物治療前景。

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