馬福敏，徐美玲，郭小瑞，郭乃菲，單舒筠，鮑士寶

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600;2.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽233100)

小麥是一種特殊的加工主食面包的原料，其特殊性一方面歸因于面筋蛋白。因為和面時，面筋蛋白形成彈性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有較強的持氣能力［1］。然而，面粉中的另一種成分——戊聚糖(其中主要是水不溶性戊聚糖，water unetractable pentosan，WUP)含量雖然較面筋蛋白低，但可吸收相當于自身重量3.5～10倍的水［2］。另外，Izydorczyck 等證明 WUP 可穩(wěn)定蛋白質(zhì)泡沫，減少蛋白質(zhì)膜的熱損傷［3］。Wang等認為WUP與面筋蛋白存在直接或間接的相互作用［4-6］。所以WUP對面團及面包的性質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。隨著人們對WUP應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴大，人們對其組成及結(jié)構(gòu)有了不斷深入的了解。通常認為WUP是由吡喃木糖單元通過β-(1→4)糖酐鍵連接的主鏈，C(O)2和(或)C(O)3位上連接阿拉伯呋喃糖側(cè)鏈構(gòu)成［7-8］。有些阿拉伯糖側(cè)鏈還通過酯鍵與阿魏酸等酚酸相連。WUP與水溶性戊聚糖的差別在于其具有相對大的分子量及高的A/X值［9］。WUP的這種線性結(jié)構(gòu)使其呈棒狀，可水化形成粘稠的水溶液［10］。由于WUP與纖維素等細胞壁物質(zhì)緊密連接，因此較水溶性戊聚糖難以與細胞壁其他成分分離。目前主要采用堿法提取水不溶性戊聚糖。常用的堿有 NaOH、Ca(OH)2、Ba(OH)2等。鄭學(xué)玲等［11］對前兩者提取麩皮中WUP進行了工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，以NaOH為溶劑時，在最佳條件下，提取率較低(＜11%)。為了研究WUP結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，應(yīng)首先建立一種高效的提取方法。全麥粉中WUP含量較普通面粉高，因此WUP與面筋蛋白之間的相互作用對面團的流變性質(zhì)及全麥面包等產(chǎn)品有較大的影響。在全麥粉這樣復(fù)雜的體系中要研究其中的某種成分，通常是將這種成分提取出來，先進行單一成分功能性質(zhì)的研究，然后在實際體系(即全麥面團或全麥面包)中，研究其它成分對它的影響。從全麥粉中提取WUP與其他原料(麥麩)相比，應(yīng)首先將淀粉、脂肪及面筋蛋白等去除，而后從得到的粗提物中提取WUP。本研究選擇以上三種堿進行提取效果的比較，選擇最合適的堿，并優(yōu)化提取工藝，以確定水不溶性戊聚糖的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全麥粉 中糧鵬泰面粉有限公司;間苯三酚、D-木糖 美國Sigma公司;葡萄糖 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站;3，5-二硝基水楊酸(DNS) 上?；瘜W(xué)試劑公司;其他試劑均為分析純;耐高溫α-淀粉酶(2×104IU/mL)及高轉(zhuǎn)化率糖化酶(1×105IU/mL)

無錫杰能科生物有限公司;堿性蛋白酶(Alcalase2 4L)(1×104IU/mL) 丹麥諾維信(Novo)公司。

DGG-9070A電熱鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;722分光光度計、DDS-11C電導(dǎo)率儀

上海精密科學(xué)儀器有限公司;TG328A電光分析天平 上海天平儀器廠;DELTA320精密p H計 上海雷磁儀器廠;超級恒溫器 上海市實驗儀器廠;Sigma4K 15高速冷凍離心機 德國;ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所;酶反應(yīng)器自制;195LABCONO冷凍干燥設(shè)備 英國。

1.2 實驗方法

1.2.1 全麥粉中水不溶性戊聚糖粗提物制備工藝流程 工藝流程參考文獻［8-11］并加以調(diào)整。

200g小麥粉(滅酶)+1000mL水→室溫攪拌1h→離心(3600r/min，15min)→殘渣+600mL水→調(diào)節(jié)pH至6.0，加熱沸騰至完全糊化→耐高溫α-淀粉酶攪拌→冷卻到60℃，pH調(diào)到4.2→加入高轉(zhuǎn)化率糖化酶→100℃下滅酶10min→離心(8000r/min，20min)→殘渣+600mL水→60℃恒溫，pH調(diào)至9.0→加入堿性蛋白酶→100℃滅酶10min→反復(fù)離心至上清液清澈為止→冷凍干燥→水不溶性戊聚糖粗提物(crude water unextractable pentosan，CWUP)

1.2.2 CWUP中WUP的提取方法 工藝流程參考文獻［12-13］并加以調(diào)整。

在酶反應(yīng)器中加入CWUP 2.0g，加入堿溶液，當超級恒溫水浴鍋中水的溫度升高到設(shè)定的溫度時，攪拌反應(yīng)，調(diào)節(jié)p H至7.0，離心后取上清液，真空濃縮，透析直至透析液的導(dǎo)電率小于2.5×102μs/cm(與去離子水的導(dǎo)電率相當)，冷凍干燥，得到WUP。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 總糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法［14］。標準曲線方程:y=0.0039x-0.0032(R2=0.999)。按公式(1)計算總糖含量:

式中:C-標準曲線中查得葡萄糖的含量(mg);D-樣液的稀釋倍數(shù);W-樣品的質(zhì)量(mg)。

1.2.3.2 戊聚糖含量的測定 地衣酚-鹽酸法［15］。標準曲線方程如下:y=0.003x-0.0182(R2=0.9955)。根據(jù)公式(2)計算戊聚糖含量:

式中:μ-標準曲線中查得的木糖含量(mg);0.88-木糖換算為阿拉伯木聚糖的系數(shù);m-樣品的質(zhì)量(mg)。

1.2.3.3 糖醛酸含量的測定 硫酸-咔唑試劑法［16］。標準曲線方程為y=0.0007x-0.0048(R2=0.9996)。按式(3)計算糖醛酸的質(zhì)量分數(shù):

式中:AUA含量-從標準曲線上查的數(shù)據(jù)(μg);N-稀釋倍數(shù);m-樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3.4 水分含量的測定 105℃烘箱法，參照GB/T 5009.3-2003。

1.2.3.5 蛋白質(zhì)含量的測定 微量凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5-2003。

1.2.3.6 灰分的測定 馬弗爐灰化法，參照GB/T 5009.4-2003。

1.2.4 實驗方案的設(shè)計 全麥粉過110μm篩后，經(jīng)耐高溫α-淀粉酶及高轉(zhuǎn)化率糖化酶水解除去淀粉，Alcalase2 4L堿性蛋白酶水解除去蛋白質(zhì)，水洗得到WUS中主要為小麥麩皮，其中含有大量的WUP。將WUS加入堿液提取。對三種堿液、提取時間、提取溫度及料液比進行單因素實驗。在料水比為1∶50(g/mL)，提取時間是 3h，分別在 40、50、60、70、80℃下考察溫度對WUP提取率的影響;在溫度為60℃，提取時間為 3h，分別在料水比(g/mL)為 1∶50、1∶75、1∶100、1∶150、1∶200 及 1∶250 條件下考察料液比對 WUP 提取率的影響;在溫度為60℃，料水比為1∶150(g/mL)時，提取時間分別為 1、2、3、4、5h 時考察提取時間對WUP提取率的影響，以確定最佳的提取工藝條件范圍。

根據(jù)單因素實驗，對堿法提取WUP條件，采用響應(yīng)面方法進行優(yōu)化。以料液比(A)、堿提溫度(B)和提取時間(C)3個因素作為自變量，以WUP提取率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗(Response Surface Methodology，RSM)，因素水平見表 1。

表1 RSM實驗因素及水平表Table 1 Independent variables and levels of RSM

1.2.5 提取率的計算 提取率計算公式如式4:

式中:mWUP為水不溶性戊聚糖的質(zhì)量(g);mCWUP為水不溶性戊聚糖粗提物的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水不溶性戊聚糖提取的單因素實驗

2.1.1 堿對水不溶性戊聚糖提取效果的影響 小麥中WUAX與細胞壁物質(zhì)如木質(zhì)素及纖維素等通過氫鍵及共價鍵緊密結(jié)合形成微晶區(qū)，OH-可使纖維素溶漲，使氫鍵斷裂，并可水解纖維素與WUP之間以FA基團連接的酯鍵，使WUP游離出來，進而與不溶性的纖維素及木質(zhì)素等分離［17］。

本研究使用不同的堿對全麥粉中WUP進行提取，并對提取率進行比較，結(jié)果見表2。

表2 不同的堿對WUP提取的影響Table 2 Effect of alkali on WUP extracting

從表2中可以看出，以NaOH為提取溶劑時，0.5mol/L濃度下提取率即可達到33.0%，但提取物中WUP含量只有58.09%左右。當以飽和Ca(OH)2和Ba(OH)2(含 0.26mol/L NaBH4)作溶劑時，與0.5mol/L NaOH相比，提取率下降，但WUP含量大幅度提高。這是由于NaOH不僅可提取WUP，也將細胞壁的主要成分纖維素及少量的葡聚糖一同提取出來。研究表明二價陽離子的存在對于WUP的選擇性提取非常重要［18-19］。室溫下(26℃)Ca(OH)2飽和溶液溶解度很低，并且溶解度隨溫度的升高而下降，其濃度不足以溶出大量細胞壁中的 WUP。但Ba(OH)2作溶劑能克服上述缺點，Cyran等［20］研究表明Ba2+可與細胞壁中的β-葡聚糖作用形成不溶于Ba(OH)2飽和溶液的物質(zhì)，可通過離心除去。大大提高了 WUAX的提取效率。此外，溶液中加入NaBH4一方面可提高Ba(OH)2對WUP的選擇性，另一方面可防止溶解在堿溶液中的WUP發(fā)生降解。

因此本實驗選用飽和Ba(OH)2(含0.26mol/L NaBH4)作溶劑提取，并對此提取工藝作進一步的優(yōu)化。

2.1.2 溫度對提取率的影響 料水比為1∶50(g/mL)，提取時間是 3h，分別在 40、50、60、70、80℃下提取WUP，結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對提取率的影響Fig.1 Influence of temperature on extraction yield

由圖1可以看出，隨溫度的升高，提取率隨之增大，當溫度為60℃時，提取率增加最為明顯，繼續(xù)提高溫度，提取率增加幅度減小。

2.1.3 料水比對提取率的影響 溫度為60℃，提取時間為 3h，分別在料水比為 1∶50、1∶75、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250(g/mL)條件下提取戊聚糖，結(jié)果見圖 2。

從圖2可以看出，隨著水的增加，提取率得到很大提高。當料水比達到1∶150(g/mL)時，繼續(xù)增加水含量對提取率的影響減小。這是因為隨溶劑量增大，粗提物與溶劑接觸界面處的濃度差增大，從而傳質(zhì)速率提高，提取率增大。當料水比為 1∶150(g/mL)時，再增加溶劑用量，提取率基本保持不變。另外，從節(jié)省資源，減少污染的角度考慮，應(yīng)盡量降低飽和Ba(OH)2的用量。

圖2 料水比對提取率的影響Fig.2 Influence of the ratio of liquid to solid on extraction yield

2.1.4 提取時間對提取率的影響 溫度為60℃，料水比為1∶150(g/mL)時，提取時間分別為 1、2、3、4、5h時提取戊聚糖，以確定最佳的提取工藝條件。結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對提取率的影響Fig.3 Influence of time on extraction yield

根據(jù)液固萃取基本理論，延長提取時間將有利于溶質(zhì)的提取，從圖3可以看出當提取時間小于3h時，隨著提取時間的延長提取率隨之增加，且增加幅度較大，這是因為提取時間過短，溶劑與粗提物還沒有充分的接觸，所以增加提取時間有利于提取率的提高。提取時間到達3h時，提取率增幅減小，可見在3h內(nèi)提取過程基本完成，時間對提取率的影響減小。

2.2 工藝優(yōu)化

2.2.1 實驗設(shè)計 綜上分析選取如下水平值進行工藝優(yōu)化，用Design Expert軟件進行工藝優(yōu)化實驗設(shè)計，實驗結(jié)果如表3所示。

由軟件擬合得到回歸方程如下:Y=31.12+2.03A+2.52B+0.65C+1.51AB-0.40AC-0.87BC-3.81A2-10.47B2-6.25C2，從回歸方程可以看出，溫度對戊聚糖的提取率影響最大，料水比次之，而提取時間影響最小。由交互項的系數(shù)可以看出提取溫度和料水比的影響較大。這一結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.2 各因素的交互作用對WUP提取率的影響通過多元回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖(圖4～圖6)，所擬和的響應(yīng)曲面和等高線圖能比較直觀的反映各因素和各因素間的交互作用，由圖圖4～圖6可以看出，3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，A(料水比)、B(提取溫度)和C(提取時間)3個因素與WUP的提取率呈拋物線關(guān)系，且在考察范圍內(nèi)存在響應(yīng)值(WUP的提取率)的極高值。

表3 實驗方案及實驗結(jié)果Table 3 Experiment design and results

圖4為提取時間為3h時，料水比與提取溫度的交互影響。從圖中可以很直觀的看出溫度在60℃時，提取率在最高的范圍內(nèi)，當料水比達到1∶150(g/mL)時，提取率達到最大值32.74%，料水比繼續(xù)增加對提取率影響不大。當提取率為26.68%時，料水比需要提高一倍才能達到32.74%，而達到同樣的提取率溫度只需上升10℃，所以可以得出溫度對提取率的影響更顯著，從而可以通過控制溫度來有效地減少料水比，節(jié)約原料。

圖4 料水比與提取溫度對戊聚糖提取率的影響Fig.4 Influence of the ratio of liquid and solid and temperature on extraction yield

圖5 為提取溫度為60℃時，料水比與提取時間之間的交互關(guān)系。從圖中可以看出，這兩個因素的交互影響不是很顯著，提取時間對提取率的影響大于料水比，在一定范圍內(nèi)，可以適當?shù)奶岣咛崛r間，減少料水比，從而可以有效的節(jié)約原料。在料水比為1∶150(g/mL)，提取時間為3h時提取率最大。

圖6為提取時間與提取溫度對戊聚糖提取率的影響。適當增加料水比與提取時間有利于提高戊聚糖的提取率。這兩個因素的交互影響也不顯著，但是可以得出提取溫度對提取率的影響大于提取時間，可以適當?shù)目刂铺崛〉臏囟葋頊p少提取時間，從而提高單位時間戊聚糖的產(chǎn)量。在提取時間為3h，提取溫度為62℃時得到最佳提取率32.74%。

圖5 料水比和提取時間對戊聚糖提取率的影響Fig.5 Influence of the ratio of liquid and time on extracton yield

圖6 提取溫度與提取時間對戊聚糖提率的影響Fig.6 Influence of temperature and time on extraction yield

2.2.3 方差分析及提取率與過程參數(shù)回歸方程的擬合 方差分析結(jié)果如表4。從表4可以看出，回歸模型顯著，失擬項不顯著，說明模型擬合較好。各因素對提取率的影響依次為B＞A＞C，即提取溫度對提取率的影響最大，其次為料水比，提取時間對提取率的影響最小。模型的一次項不顯著，而二次項顯著，說明單個因素對提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項中提取溫度高度顯著，對提取率影響尤其大，這與擬合方程得到的結(jié)果一致。R2=0.9191，說明該模型與實驗數(shù)據(jù)擬合較好，可以用于提取戊聚糖的理論預(yù)示。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

綜上所述，用響應(yīng)面分析得到最佳提取工藝條件為料水比1∶188.07(g/mL)，溫度63℃，提取時間3h，提取率為31.60%?？紤]到實際操作的局限性，同時達到節(jié)省時間、節(jié)約試劑、提取效果好的目的，提取工藝條件調(diào)整為:料水比1∶188(g/mL)，浸提溫度65℃，浸提時間3h。結(jié)果顯示W(wǎng)UP的實際提取率為31.87%，與理論預(yù)測值基本一致。

2.3 提取物的主要成分

在最佳工藝條件下提取得到的提取物中戊聚糖含量的多少決定能否進行后續(xù)的純化及戊聚糖功能性質(zhì)的研究，因此，本研究對提取物中主要成分進行分析，結(jié)果見表5。

表5 最佳工藝條件下提取物中主要成分的含量Table 5 Components of the extractant extracted at the optimum condition

由表5可以看出，最佳工藝條件下得到的產(chǎn)品戊聚糖含量很高。在此條件得到的產(chǎn)物，與用NaOH及Ca(OH)2最佳工藝條件下得到的產(chǎn)物相比，戊聚糖含量提高了12%～16%［12］，大大提高了提取效率。

3 結(jié)論

通過不同的堿對WUAX的提取率以及產(chǎn)品戊聚糖含量比較，發(fā)現(xiàn)Ba(OH)2的提取效果最好;單因素實驗結(jié)果表明，溫度為60℃左右，料水比為1∶150左右，時間為3h左右時，小麥粉中戊聚糖提取率較大;響應(yīng)面分析得到Ba(OH)2提取戊聚糖的最佳工藝條件為:料水比1∶188.07(g/mL)，提取溫度63℃，提取時間3h，提取率為31.60%;通過驗證實驗確定為料水比1∶188(g/mL)，溫度65℃，提取時間3h時，提取率達31.87%，與理論預(yù)測值基本吻合。方差分析結(jié)果顯示各因素對提取率影響的模型顯著(p＜0.05)，提取溫度的平方項對提取率的影響高度顯著(p＜0.001);最佳工藝條件下得到的提取物中總糖，戊聚糖及糖醛酸含量分別為95.33%、92.09%及3.24%。

［1］Courtin C M，Delcour J A.Arabinoxlans and endoxylanase in wheat flour bread-making［J］.Journal of Cereal Science，2002，35:225-243.

［2］李利民，侯業(yè)茂，朱永義，等.谷物戊聚糖國內(nèi)外研究進展［J］.糧油加工與食品機械，2002(5):36-38.

［3］Sarker D K，Wilde P J.Enhancement of protein foam stability by formation of wheat arabinoxylan-protein crosslinks［J］.Cereal Chemistry，1998，75:493-499.

［4］Wang M，Hamer R J.Effect of water unextractable solids on gluten formation and properties:mechanistic considerations［J］.Journal of Cereal Science，2003，37:55-64.

［5］Wang M，Oudgenoeg G.Interaction of water unextractable solids with gluten protein:effect on dough properties and gluten quality［J］.Journal of Cereal Science，2003，38:95-104.

［6］Wang M，Vliet T V.Interaction of water unextractable solids and xylanase with gluten protein:effect of wheat cultivar［J］.Journal of Cereal Science，2005，41:251-258.

［4］Bergmans M E F，Beldman G H，Gruppen，et al.Optimisation of the selective extraction of(Glucurono)arabinoxylans from wheat bran:use of barium and calcium hydroxide solution at elevated temperatures［J］.Journal of Cereal Science，1996，23:235-245.

［5］Barron C，Robert P，F(xiàn)abienne G，et al.Structural heterogeneity of wheat arabinoxylans revealed by Raman spectroscopy［J］.Carbohydrate Research，2006，341:1186-1191.

［6］Gruppen H，Komelink F J M，Voragen A G J.Waterunextractable cell wall material from wheat flour.III.A structural model for arabinoxylans［J］.Journal of Cereal Science，1993，19:111-128.

［7］Izydorczyk M S，Biliaderis CG.Cereal arabinoxylans:advances in structure and physicochemical properties［J］.Carbohydrate Polymers，1995，28:33-48.

［8］Faurot A-L，Saulnier L，Brot S，et al.Large scale isolation of water-soluble and water-insoluble pentosans from wheat flour［J］.Lebensm-Wiss u-Technol，1995，28:436-441.

［9］周素梅.阿拉伯木聚糖在焙烤制品中的功能性質(zhì)的研究［D］.無錫:無錫輕工大學(xué)食品學(xué)院，2000.

［10］Maes C，Delcour J A.Structural characterisation of waterextractable and water-unextractable arabinoxylans in wheat bran［J］.Journal of Cereal Science，2002，35:315-326.

［11］鄭學(xué)玲.小麥麩皮戊聚糖的分離制備、理化性質(zhì)及功能特性研究［D］.無錫:江南大學(xué)食品學(xué)院，2002.

［12］Verbruggen M A，Beldman G，Voragen A G J.The selective extraction of glucuronoarabinoxylans from sorghum endosperm cell walls using barium and potassium hydroxide solutions［J］.Journal of Cereal Science，1995，21:271-282.

［13］Hollmann J，Lindhauer M G.Pilot-scale isolation of glucuronoarabinoxylans from wheat bran［J］.Carbohydrate Polymers，2005，59:225-230.

［14］李建武.生物化學(xué)實驗原理與方法［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1997:25-29.

［15］周素梅，王璋，許時嬰.面粉中戊聚糖含量測定方法的探討［J］.食品工業(yè)科技，2000，21(6):70-72.

［16］王璋，許時嬰.食品化學(xué)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2006:33-52.

［17］Izydorczyka M S，MacGregor A W.Evidence of intermolecular interactions of β-glucans and arabinoxylans［J］.Carbohydrate Polymers，2000，41:417-420.

［18］Mandalari G，F(xiàn)aulds CB，Sancho A I，et al.Fractionation and characterisation of arabinoxylans from brewers’spent grain and wheat bran［J］.Journal of Cereal Science，2005，42:205-212.

［19］Huisman M M H，Schols H A，Voragen A G J.Glucuronoarabinoxylans from maize kernel cell walls are more complex than those from sorghum kernel cell walls［J］.Carbohydrate Polymers，2000，43:269-279.

［20］Cyran M，Courtin CM，Delcour JA.Heterogeneity in the fine structure of alkali-extractable arabinoxylans isolated from two rye flours with high and low breadmaking quality and their coexistence with other cell wall components［J］.Journal of Agricultulure and Food Chemistry，2004，52(9):2671-2680.