胡 平，林開春

(1．恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，湖北 恩施445000;2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢430070)

交沙霉素(Josamycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomyces narbonensisvar．Josamyceticus)產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)與柱晶白霉素的A3 組分相同［1－2］，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1．交沙霉素最早由日本山之內(nèi)制藥株式會(huì)社于1964 年研制而成［3－4］，而后研究人員于1980 年完成了交沙霉素的全合成［5］．交沙霉素自誕生就在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于臨床，常用于副鼻竇炎、支氣管炎、肺炎、呼吸道感染、中外耳炎、術(shù)后感染、皮膚感染和口腔科、五官科、泌尿科感染等，效果顯著．但在我國(guó)交沙霉素的工業(yè)發(fā)酵水平很低，生產(chǎn)成本高，使得國(guó)內(nèi)尚無(wú)廠家生產(chǎn)原藥．交沙霉素的生產(chǎn)主要靠進(jìn)口原料藥，嚴(yán)重阻礙了國(guó)內(nèi)交沙霉素藥物的發(fā)展，必須提高交沙霉素的發(fā)酵生產(chǎn)能力，一方面提高提高生產(chǎn)菌種的產(chǎn)素能力，另一方面重視發(fā)酵工藝的選擇［5－6］．本研究通過(guò)對(duì)誘變前后的兩個(gè)菌株發(fā)酵曲線的比較，探討了誘變前后菌株發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化，為選擇交沙霉素的發(fā)酵工藝提供參考．

圖1 交沙霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig．1 Molecular structure of Josamycin

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 儀器與試劑 ①儀器:雙人單面垂直潔凈工作臺(tái)(上海蘇凈)，H－2050R 高速冰凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀)，高效液相色譜儀(BECKMAN GOLDEN50)，16L 機(jī)械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐(江蘇科海)，TKY－I 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜(上海杜科)，BT224S 電子天平(賽多利斯)，UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美)．②試劑:苯酚溶液:稱取10 g 苯酚，用95%的乙醇定容至100 mL;磷酸緩沖液:0．02 mol/L KH2PO4溶液，用1 mol/L 的H3PO4調(diào)節(jié)pH 值為3，備用．

1．1．2 試驗(yàn)菌株 交沙霉素生產(chǎn)菌株由武漢天惠生物工程有限公司研究所提供．試驗(yàn)菌株JM8 是出發(fā)菌株，菌株R18 是JM8 誘變的高產(chǎn)菌株．

1．1．3 培養(yǎng)基 ①孢子斜面培養(yǎng)基:土豆泥10%，麥片2．5%，精氨酸0．02%，瓊脂2%，消前pH7．2～7．4;②種子培養(yǎng)基:黃豆餅粉1．5%，淀粉1．0%，葡萄糖1．0%，酵母粉0．5%，MgSO40.05%，CaCO30．3%，K2HPO40.5%，消前pH8．0;③發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉4．0%，棉籽餅粉2．0%，面筋粉2．0%，葡萄糖2．0%，豆油1．0%，CaCO30．3%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%，消前pH8．0．

1．1．4 參考品 交沙霉素標(biāo)準(zhǔn)品為杭州民生藥業(yè)生產(chǎn)的交沙霉素糖衣片，用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的母液標(biāo)樣，用0．25 μm 濾膜過(guò)濾除菌除雜質(zhì)，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1．1．5 DNS 溶液(Ghose 法) 稱取6．9 g 結(jié)晶酚溶解于15．2 mL 10%的氫氧化鈉溶液中，用水稀釋至69 mL，并加入6．9 g 亞硫酸鈉配制成甲液;將255 g 酒石酸甲鈉溶解于300 mL 10%的氫氧化鈉溶液中，再加入1%的3，5－二硝基水楊酸溶液880 mL 配制成乙液;將甲、乙溶液混合儲(chǔ)存于棕色瓶中，室溫下放置7～10 d后使用，1 年內(nèi)有效．

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 發(fā)酵工藝流程 將JM8 菌株和R18 菌株分別接種于茄瓶斜面孢子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～10 d，洗下孢子接入種子培養(yǎng)基，于28℃搖床(180 r/min)，培養(yǎng)時(shí)間30h，按10%的接種量接入16 L 發(fā)酵罐，裝料量為10 L，通氣量5 L/min，轉(zhuǎn)速210 r/min，罐壓0．02 MPa，28℃發(fā)酵10 d，分別在發(fā)酵3．0、4．0、5．0、6．0、6．5、7.0、7.5、8．0、8．5、9．0 d 時(shí)取發(fā)酵樣液備用．

1．2．2 高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵效價(jià) 將待測(cè)溶液用0．25 μm 濾膜過(guò)濾，取上清液上C18 反向色譜柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4．6 mm×250 mm)，以磷酸緩沖液－甲醇(體積比為20 ∶80，pH 3)為流動(dòng)相，進(jìn)樣10 μL;控制流速為1．0 mL/min，232 nm 檢測(cè);參考品的配制同1．1．4．

1．2．3 菌絲濕重的測(cè)定 取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵樣液10 mL 于4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，除去上清液備用，稱取濕菌絲重量．

1．2．4 發(fā)酵液中總糖和還原糖濃度的測(cè)定(DNS 分光光度法)［7］吸取發(fā)酵上清液1 mL，加入1 mL 6 mol/L的鹽酸，沸水浴30 min，用去離子水適當(dāng)稀釋，即為總糖測(cè)定稀釋液;吸取發(fā)酵上清液1 mL，用去離子水適當(dāng)稀釋，即為還原糖測(cè)定稀釋液．分別取稀釋液1 mL 于比色管中，加入1 mL DNS 溶液，沸水浴10 min，取出冷卻至室溫，加入4 mL 去離子水混勻，以空白的發(fā)酵液為對(duì)照，測(cè)定540 nm 處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得原發(fā)酵液總糖和還原糖濃度．

1．2．6 發(fā)酵液濾速的測(cè)定 用移液管吸取不同發(fā)酵時(shí)間的樣液30 mL，用濾紙過(guò)濾，測(cè)量2 min 的濾液體積．

2 結(jié)果與分析

2．1 碳源濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

取少量葡萄糖于105℃烘干至恒重，稱取烘干的葡萄糖0．1 g，加去離子水配制成1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液．將母液依次稀釋，配制成100、150、200、250、300、350、400 μg/mL 等7 個(gè)不同濃度的標(biāo)樣，取各種濃度標(biāo)樣1 mL，加入1 mL 的DNS，沸水浴10 min，冷卻至室溫，再加入4 mL 的去離子水稀釋混勻，測(cè)定540 nm 下吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，曲線方程為:y=0．003 3x－0．149 2，R2=0．999 3，可以看出，DNS法能準(zhǔn)確地標(biāo)定溶液中葡萄糖的濃度．

稱取干燥的氯化銨0．382 g，用去離子水定容至100 mL，即為銨氮濃度為0．1%的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將母液稀釋1 000 倍即銨氮濃度為1 mg/L，作為溶液A．分別取A 液0、20、40、50、60、80 mL，再加入去離子水定容至100 mL，作為標(biāo)樣;取以上不同濃度的標(biāo)樣各10 mL，加入0．4 mL 的苯酚溶液，搖勻，再向其中加入0．4 mL 0．5%的亞硝基鐵氰化鈉溶液，再次搖勻，并分別向其中加入1 mL 的C 液，搖勻，靜置1 h，在640 nm 波長(zhǎng)下，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，求出曲線方程為y=1．2532x+0．0203，R2=0．9998，表明該方法能準(zhǔn)確地標(biāo)定溶液中的濃度．

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光曲線Fig．2 Extinction curve of glucose standard solution

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光曲線Fig．3 Extinction curve of standard solution

2．3 菌株JM8 和R18 發(fā)酵過(guò)程中代謝曲線測(cè)定結(jié)果

按照方法1．2．1 對(duì)菌株JM8 和R18 分別上罐發(fā)酵，用酸度計(jì)測(cè)定發(fā)酵樣液的pH 值，并按方法1．2．2、1．2．3、1．2．4、1．2．5 和1．2．6 測(cè)定發(fā)酵效價(jià)、菌絲濕重、糖濃度、濃度和濾速，具體結(jié)果見(jiàn)表1～2，繪制代謝曲線見(jiàn)圖4～5．

表1 菌株JM8 的代謝參數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Tab．1 The relationship of some metabolic parameters and cultivation time of JM8

從圖4 和圖5 可以看出，菌株R28 在發(fā)酵液中比菌株JM8 生長(zhǎng)更快，延遲期也更短，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體能迅速利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入產(chǎn)物合成期后，菌體濃度變化不大，發(fā)酵液的pH 值緩慢升高，碳源和氮源物質(zhì)的消耗變慢，交沙霉素逐漸積累．發(fā)酵液的濾速先升后降，主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中玉米淀粉因逐漸消耗而使發(fā)酵液慢慢變稀，隨后又因發(fā)酵代謝物的增加又開始變稠;隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌絲濕重和發(fā)酵效價(jià)逐漸增加，在發(fā)酵5d效價(jià)大幅度提高，且發(fā)酵液中總糖和還原糖的濃度迅速下降，的濃度也緩慢下降，表明交沙霉素的積累與發(fā)酵液中碳源的利用具有較強(qiáng)的相關(guān)性，發(fā)酵8 d 效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)，但是濃度幾乎不變，而在8～9 d，濃度陡然升高，可能是菌絲體老化自溶，釋放氮源物質(zhì)的緣故，此時(shí)發(fā)酵效價(jià)甚至表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，所以應(yīng)把握好發(fā)酵時(shí)間，以發(fā)酵8 d 放罐為宜．

圖4 菌株JM8 發(fā)酵液中各代謝參數(shù)曲線Fig．4 Metabolic parameters of JM8 fermentation fluid

圖5 菌株R18 發(fā)酵液中各代謝參數(shù)曲線Fig．5 Metabolic parameters of R18 fermentation fluid

3 討論

交沙霉素是那波鏈霉菌交沙霉素變種的一級(jí)代謝產(chǎn)物［9］，其生物合成的內(nèi)脂環(huán)是由5 個(gè)乙酸單位、1 個(gè)羥基乙酸單位、1 個(gè)丁酸單位、1 個(gè)丙酸單位通過(guò)聚酮體途徑縮合而成．比較2 個(gè)菌株發(fā)酵的代謝曲線，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期兩個(gè)菌株的發(fā)酵液pH 的變化不大，到了中后期發(fā)酵液的pH 值逐漸升高，但的濃度與pH沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)性．因此在發(fā)酵中期應(yīng)注意對(duì)pH 值的調(diào)控，使pH 適宜降低，且控制在5．7 以上．誘變菌株R18 比出發(fā)菌株JM8 能更好的利用能源物質(zhì)，且菌體生長(zhǎng)快，表明交沙霉素的發(fā)酵工藝條件選擇，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方更重要，能被菌株很好利用的能源物質(zhì)配比才能有效發(fā)揮菌株的產(chǎn)素能力，碳源曲線變化最快時(shí)，效價(jià)曲線變化也最快．所以在生產(chǎn)中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)碳源代謝加快時(shí)，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)入一些碳源，使菌種在一個(gè)較為穩(wěn)定的環(huán)境中生長(zhǎng)和產(chǎn)素，這與交沙霉素的生物合成原理相符．氮源曲線的變化則表明，生產(chǎn)過(guò)程中濃度應(yīng)保持在300～400 g/L，如果濃度陡然上升，則發(fā)酵異常對(duì)產(chǎn)素不利，發(fā)酵8 d 效價(jià)最高，因而在生產(chǎn)中要把握好發(fā)酵周期，不宜過(guò)長(zhǎng)．否則，會(huì)導(dǎo)致交沙霉素的提煉困難，費(fèi)時(shí)費(fèi)料．

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