宋 宇 魏志玄

南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 南陽(yáng) 473000

目前，圍繞膠質(zhì)瘤病因和發(fā)病機(jī)制的研究非常普遍。其中，細(xì)胞凋亡在膠質(zhì)瘤發(fā)病中的作用越來(lái)越受重視。HtrA蛋白家族是一類寡聚絲氨酸蛋白酶，作為其成員之一的HtrA2在某些病理或應(yīng)激狀態(tài)下釋放至胞漿可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HtrA2作為一種前凋亡因子的作用已經(jīng)在很多研究中得到確認(rèn)，其活性降低可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)展。本文采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤中HtrA2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本與資料 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；SD 大鼠購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所用一抗為兔抗Omi／HtrA2多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司），封閉劑、二抗、DAB 顯色試劑盒（英國(guó)Novolink公司），胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)sigma公司；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Leica QWin Image Processing and Analysis System.英國(guó)Leica Imaging System Ltd公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）采用C6細(xì)胞立體定向移植的方法構(gòu)建大鼠膠質(zhì)瘤模型，成功后取腫瘤組織標(biāo)本；（2）采用非生物素檢測(cè)系統(tǒng)：4mm 石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，檸檬酸緩沖液微波法修復(fù)抗原；（3）加3%雙氧水20min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性；5%兔封閉血清室溫下封閉20 min；加Omi／HtrA2抗體（1∶400），4℃過(guò)夜；加第2抗體室溫下孵育20min；加鏈抗親和素室溫下孵育20min；DAB染色，顯微鏡下觀察，滿意后終止，封片。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)Omi／HtrA2的免疫組化染色的強(qiáng)度和范圍進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)雙側(cè)α＝0.05。

2 結(jié)果

HtrA2蛋白在正常大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞化學(xué)染色均有陽(yáng)性表達(dá)（圖AB），DAB棕黃色顆粒著色在胞漿中，實(shí)驗(yàn)組20 例，18 例陽(yáng)性表達(dá)；正常對(duì)照組20 例，1例陽(yáng)性表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)高于正常腦膠質(zhì)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖A：正常細(xì)胞；圖B：膠質(zhì)瘤細(xì)胞

3 討論

生理?xiàng)l件下HtrA2是作為線粒體中的分子伴侶而發(fā)揮作用，從而促進(jìn)細(xì)胞存活而非凋亡。但在接受某些病理因素或外源性刺激的狀態(tài)下（如缺血再灌注、某些化療藥物作用、抗Fas抗體或暴露于紫外線的照射），HtrA2可轉(zhuǎn)變?yōu)榍暗蛲鲆蜃佣l(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用。成熟HtrA2蛋白的N 端包含一個(gè)四肽基序，可與各種凋亡抑制蛋白（IAPs）發(fā)生相互作用。當(dāng)接受到凋亡刺激后，HtrA2 從線粒體釋放至胞漿中，并 降 解 各 種IAPs，如XIAP、cIAP1、cIAP2 和Apollon／BRUCE。由于IAPs被分解導(dǎo)致caspase3、7、9激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］。用十字孢堿處理HeLa細(xì)胞，觀察到HtrA2釋放到胞漿中并與一種絲氨酸-蘇氨酸激酶WARTS（一種潛在的腫瘤抑制蛋白）結(jié)合成復(fù)合物。HtrA2-WARTS與XIAP發(fā)生作用并將其水解。表達(dá)WARTS的HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出更易受十字孢堿或紫外線的作用而發(fā)生細(xì)胞凋亡，當(dāng)其表達(dá)成熟的HtrA2時(shí)，這種凋亡現(xiàn)象更顯著［2］。Gupta等研究HtrA2與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在淀粉樣蛋白b積蓄導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過(guò)程中有HtrA2的參與。淀粉樣蛋白b的積蓄可導(dǎo)致HtrA2釋放至細(xì)胞質(zhì)并與早老素1發(fā)生交互作用，其 結(jié) 果 是 使HtrA2 對(duì)XIAP、cIAP1 和cIAP2 的 水 解 活性增強(qiáng)，從而引發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生caspase依賴性的細(xì)胞凋亡過(guò)程。

HtrA2除可以分解凋亡抑制蛋白IAP之外，還能分解其他一些表現(xiàn)出抗凋亡活性的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞接受紫外線照射的條件下，HtrA2與胞漿中的ped／pea15蛋白結(jié)合并將其分解。Ped／pea15發(fā)揮抗凋亡作用主要是依賴于其能在多個(gè)水平上抑制caspase途徑的激活。HtrA2分解ped／pea15促進(jìn)了紫外線介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［3］。HtrA2同樣裂解抗凋亡蛋白Hax-1，后者是Bcl-2蛋白家族的成員，對(duì)線粒體膜電位起著調(diào)控作用，這個(gè)裂解過(guò)程發(fā)生于凋亡極早期的線粒體中［4］。此 外 還 有 證 據(jù) 表 明，Hax-1 對(duì)caspase9 有 抑 制 作用［5］。除了降解抗凋亡蛋白之外，HtrA2也可分裂前凋亡蛋白p73從而增強(qiáng)其作用。接受凋亡刺激后，HtrA2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并分解p73，經(jīng)過(guò)水解修飾的p73增強(qiáng)了bax基因的表達(dá)，而bax的表達(dá)產(chǎn)物可以刺激細(xì)胞凋之［6］。最近研究表明，HtrA2參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。衣霉素是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)物，用衣霉素處理細(xì)胞可以使線粒體中的HtrA2水平逐漸升高并釋放出線粒體外，顯著增加細(xì)胞凋亡比例。這些結(jié)果表明，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，HtrA2是在其中起作用的［7］。HtrA2也能通過(guò)caspase非依賴性的途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因?yàn)镠trA2 的IAP結(jié)合基序的突變可以阻止其與IAPs的結(jié)合，但不能完全廢除其促細(xì)胞凋亡的特性，這一現(xiàn)象的具體機(jī)制目前尚不清楚。

HtrA2在細(xì)胞的失巢凋亡中也發(fā)揮著作用。對(duì)失巢凋亡的抵抗是癌癥細(xì)胞的共同特性，這有助于癌癥的轉(zhuǎn)移。正常細(xì)胞脫離細(xì)胞基質(zhì)之后，某些成分的表達(dá)或活性發(fā)生改變，激活凋亡通路。這其中包括抗凋亡蛋白Bcl-XL 表達(dá)下調(diào)，從而引發(fā)各種前凋亡因子從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，這其中就包括了HtrA2。現(xiàn)已明確癌基因ras通過(guò)阻止HtrA2釋放出線粒體外從而抑制失巢腸上皮細(xì)胞的凋亡。在這個(gè)模型中，外源性表達(dá)HtrA2 可以增加失巢細(xì)胞的凋亡傾向［8］。目前有證據(jù)表明，HtrA2參與腫瘤發(fā)生。HtrA2廣泛表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞系，并且其表達(dá)程度具有細(xì)胞特異性。已發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)成熟HtrA2可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)活檢標(biāo)本的分析表明，HtrA2的表達(dá)水平在腫瘤組織和正常組織中存在差異。HtrA2蛋白水平在子宮內(nèi)膜癌組織中顯著降低［9］，在卵巢腫瘤中也有下降，尤其是良惡交界性卵巢腫瘤［10］。與此相反，HtrA2 在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)而在正常前列腺或前列腺良性增生組織中低表達(dá)或不表達(dá)。這個(gè)現(xiàn)象可能與前列腺癌細(xì)胞分化有關(guān)［11］。HtrA2同樣在高級(jí)別胃腺癌中高表達(dá)，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期雌激素處理金黃地鼠腎細(xì)胞誘發(fā)的腫瘤中，HtrA2 同樣高表達(dá)［12］。HtrA2 在癌癥起源中的地位尚未完全研究清楚。然而，鑒于HtrA2在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，那么它與腫瘤發(fā)展之間的關(guān)系是顯而易見(jiàn)的，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞之所以增殖是因?yàn)槠湟种屏四軌蛞l(fā)細(xì)胞凋亡的各種機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HtrA2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，其與腫瘤發(fā)展之間的關(guān)系需要進(jìn)一步探討。

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