何曉英 付 華 袁 平 譚 華 李小剛△

瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1）神經(jīng)內(nèi)科 2）乳腺外科 瀘州 646000

近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）作為生物大分子可穿過大鼠血腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的非造血功能。Laske等［1］報道早期阿爾茨海默?。ˋD）患者血漿G-CSF水平降低，外源性G-CSF有望作為AD 新的治療策略；實驗變態(tài)反應(yīng)性腦炎模型（EAE）證實G-CSF 在腦內(nèi)具有抗炎功能；Sevimli［2］通過基因沉默技術(shù)比較內(nèi)源性G-CSF 缺乏及G-CSF替代治療的腦梗死大鼠，發(fā)現(xiàn)后者梗死灶較前者顯著縮小，神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于前者。腦出血（intracerebral haemorrhage，ICH）是全球公共衛(wèi)生共同關(guān)注的常見和多發(fā)疾病，嚴重威脅人類健康，G-CSF 對其是否同樣具有神經(jīng)保護作用，本研究通過構(gòu)建ICH 模型，從星形膠質(zhì)細胞（astrocyte，Ast）可塑性的角度，探討G-CSF對ICH 大鼠發(fā)揮的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：由瀘州醫(yī)學院動物實驗中心提供48只成年Sprague-Dawley大鼠，SPF級，體質(zhì)量250～320g，整個實驗過程對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.1.2 藥物與試劑：重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF，商品名瑞血新），購自深圳新鵬生物工程有限公司；兔抗鼠GFAP抗體，購自NeuMarker 公司；二抗（羊抗兔IgG）、SABC試劑盒和DAB 顯色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器：WDT-V 型鼠腦立體定向儀（西安西北光電儀器廠）；50μL微量進樣器（上海激光醫(yī)學儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 分組與用藥：按隨機數(shù)字表法將大鼠分成三組：假手術(shù)組（n＝12）、模型組（n＝18）、治療組（n＝18），每組又分為6 h、24h、48h、72h、7d、10d六個亞組（假手術(shù)組n＝2，模型組、治療組各n＝3）。治療組于造模1h 后腹腔注射rhGCSF 60μg／kg，假手術(shù)組、模型組僅注入等容量等滲鹽水。

1.2.2 ICH 模型制備：2%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，然后將其俯臥固定于立體定位儀上。以尾狀核（前囟前0.2mm，中線右側(cè)旁開3mm，深6mm）為注血點，斷尾取不凝血50μL，以10μL／min速度緩慢勻速注入，注血結(jié)束后留針15min，緩慢退針（30s），縫合頭皮。假手術(shù)組以0.9%生理鹽水50μL 代替自體血，余操作同上。術(shù)中嚴格無菌操作，術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，整個實驗過程保持室溫26℃。1.2.3 模型成功評價：根據(jù)Berderson等［3］的評定方法分為4級。0級：無神經(jīng)缺失癥狀；1級：將大鼠尾巴提起，癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；2級：除1級體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時阻力較對側(cè)明顯降低；3級：除以上體征外，大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為。實驗動物大部分2h內(nèi)蘇醒。術(shù)后2h對大鼠神經(jīng)癥狀進行評定，神經(jīng)癥狀達1、2、3級判斷為模型成功，否則排除進一步實驗。

1.2.4 大鼠ICH 后各時點神經(jīng)功能障礙評分：各組分別在術(shù)前和術(shù)后各相應(yīng)處死點按Garcia等［4］方法進行神經(jīng)功能評分，最高分18分，最低分3分，分數(shù)越低，神經(jīng)功能障礙越重。

1.2.5 GFAP免疫組化檢測及陽性細胞計數(shù)：3組大鼠于術(shù)后6h、24h、48h、72h、7d、10d處死，采用4%多聚甲醛內(nèi)固定后斷頭取腦，多聚甲醛外固定，軟石蠟包埋制成蠟塊，自動切片機連續(xù)切片，片厚5μm，用于免疫組化檢測。GFAP免疫組化檢測按ABC試劑盒說明書進行。

各組于相應(yīng)時間點每只大鼠每個指標選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機選取血腫灶周4個互不重疊視野，每個時點共計16個視野。GFAP陽性表達為細胞胞漿及星狀突起纖維呈黃色或黃棕色。IPP（image-proplus 6.0）醫(yī)學圖像分析軟件計數(shù)每個視野該指標陽性細胞數(shù)，取均數(shù)為各時點該指標陽性計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）的最小顯著差法（LSD），兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。檢驗水準取α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 模型組各時間點神經(jīng)功能評分低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），48～72h降低最明顯。治療組6h、24h神經(jīng)功能評分與模型組比較無顯著差異，48h、72h、7d、10d神經(jīng)功能評分明顯高于模型組（P＜0.05），且治療組7d、10d評分與組內(nèi)其他時間點比較有顯著差異（P＜0.05），見表1。

2.2 GFAP測定 假手術(shù)組未見GFAP陽性細胞表達。模型組6h即有少量GFAP 陽性細胞表達，分布稀疏、著色較淺、胞體體積較小、突起分支較少；48h開始增多；72h出現(xiàn)大量表達；7dGFAP達高峰，胞體肥大、突起增粗且增長、著色較深，與組內(nèi)其他時點比較差異顯著（P＜0.05）；10dGFAP陽性細胞表達減少。治療組6hGFAP陽性細胞表達與模型組相似，24h、48h、72h、7d、10d 表達較模型組明顯減少（P＜0.05），細胞變形程度減輕，見表2。

表1 術(shù)后各組神經(jīng)功能障礙評分 （±s）

表1 術(shù)后各組神經(jīng)功能障礙評分 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；與模型組內(nèi)其他時間點比較，＃P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05，與治療組內(nèi)其他時間點比較，★P＜0.05

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表2 各組不同時間點血腫周圍GFAP表達 （±s）

表2 各組不同時間點血腫周圍GFAP表達 （±s）

注：“-”無GFAP陽性蛋白表達；與模型組內(nèi)其他時間點比較，P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

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3 討論

G-CSF是造血生長因子家族的一員，在臨床已廣泛用于治療血液系統(tǒng)疾病如粒細胞減少癥或腫瘤患者因化療引起的粒細胞減少等。近年來越來越多的實驗證據(jù)表明G-CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)揮著重要的非造血功能。初期學者們推測G-CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮生物學作用是由于G-CSF具有動員骨髓干細胞的功能，認為可能G-CSF 動員了骨髓干細胞，使其進入腦組織橫向分化為神經(jīng)干細胞，從而促進神經(jīng)元再生，促進神經(jīng)功能恢復(fù)［5］。隨著研究的深入，Schabitz等［6］在體外實驗發(fā)現(xiàn)，G-CSF在受到刺激的星形膠質(zhì)細胞上有表達，Schneider 等［7］采用雙重免疫標記法標記NeuN 與G-CSF，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)正常腦組織神經(jīng)元上也有G-CSF表達。另一方面，Schneider等［7］應(yīng)用免疫組化、Western Blot和RT-PCR法均證實鼠腦的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞有G-CSF受體（G-CSF-R）存在。在此基礎(chǔ)上，Hasselblatt等［8］試驗證實G-CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過與效應(yīng)細胞表面特異性G-CSFR 結(jié)合發(fā)揮生物學作用。腦組織存在內(nèi)源性G-CSF并在特定的條件下能與G-CS-R結(jié)合參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜的病理生理過程，那么，外源性G-CSF能否透過BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)呢？Solaroglu等［9］給大鼠注射碘化的G-CSF，同時采用不能通過腦組織的碘化牛血清白蛋白作為對照，在注射后1 h、4h、24h計算碘化G-CSF和碘化白蛋白的腦／血清比值，結(jié)果G-CSF顯示一個較高的腦／血清比值，證實G-CSF能夠通過完整的BBB，為外源性G-CSF 治療中樞系統(tǒng)疾病提供了科學的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

G-CSF對缺血性腦血管病神經(jīng)保護作用的研究較多，動物及部分臨床實驗均證實腦梗死后G-CSF可以減少神經(jīng)元凋亡、促進血管新生、減輕炎癥反應(yīng)、減少梗死面積等［10-11］。而G-CSF對ICH 的神經(jīng)保護作用及機制研究鮮見報道。本實驗采用斷尾取自體血法制備ICH 模型，試圖觀察G-CSF對ICH 是否具有神經(jīng)保護功能。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型各時間點神經(jīng)功能評分與假手術(shù)組比較明顯下降，且于造模后48～72h下降最明顯，說明ICH 后血腫本身及繼發(fā)的病理變化造成神經(jīng)功能嚴重損失。治療組6h、24h神經(jīng)功能評分與模型組比較無明顯差別，而48h后各時間就呈現(xiàn)出神經(jīng)功能恢復(fù)比模型組好的差異，且7d、10d神經(jīng)功能評分與組內(nèi)其他時間點比較有顯著差異，實驗結(jié)果提示G-CSF 有助于ICH 后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

實驗進一步從Ast可塑性的角度探討G-CSF促進ICH神經(jīng)功能恢復(fù)的可能機制。已知Ast是腦內(nèi)數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型，正常條件下，它對神經(jīng)元起到營養(yǎng)、支持、保護作用，并積極參與神經(jīng)元再生修復(fù)的電生理活動。受到某些外傷、應(yīng)激、腦損傷后Ast具有改變自身特性適應(yīng)損傷刺激的能力，即可塑性，稱之為Ast活化，其表型上包括：細胞數(shù)量上的增加，細胞胞體、胞核大小及突起長度的變化［12］。GFAP是Ast的標志蛋白，通過構(gòu)建支架結(jié)構(gòu)上調(diào)活化Ast的表達量，可反映Ast的活化程度［13］?；罨腁st在腦損害后有利弊雙向作用。一方面，調(diào)節(jié)細胞鉀、鈣內(nèi)外離子的濃度可增強能量代謝能力；釋放GDNF、bFGF、BDNF等營養(yǎng)成分和細胞因子；合成大量的載脂蛋白E重建神經(jīng)元完整性，修復(fù)神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［14］。另一方面，活化的Ast可產(chǎn)生大量NO，通過對大分子特別是DNA 的修飾，可導(dǎo)致細胞凋亡和壞死；可以產(chǎn)生多種細胞因子和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎性反應(yīng)，促進內(nèi)皮細胞壞死，引起B(yǎng)BB 開放，參與腦水腫病理過程；過度的膠質(zhì)化也可以作為機械屏障妨礙髓鞘和軸索的再生，影響周圍神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)［15］。因此，活化的Ast對ICH 后神經(jīng)組織是一把雙刃劍，依靠神經(jīng)系統(tǒng)代償性的自我調(diào)節(jié)不足以既發(fā)揮Ast的神經(jīng)保護作用，同時又抑制Ast神經(jīng)毒性作用，可能是導(dǎo)致ICH預(yù)后不佳的因素之一。因此，Ast在ICH 中適度活化無疑具有重要意義。

Komine-Kobayashi等［16］研究發(fā)現(xiàn)G-CSF干預(yù)腦梗死后活化的Ast減少，其表達的iNOS 被抑制，腦損害程度減輕。本實驗也觀察到假手術(shù)組無GFAP陽性細胞表達，表明Ast處于相對穩(wěn)定狀態(tài)；模型組6h開始GFAP 少許表達，隨時間延長逐漸增多，72h大量表達，7d達高峰，該規(guī)律與已有研究報道基本一致［17］；治療組6hGFAP表達與模型組相似，24h、48h、72h、7d時GFAP表達較ICH 明顯減少，細胞變形程度減輕，實驗結(jié)果提示G-CSF阻止ICH 后GFAP表達，抑制Ast過度膠質(zhì)化。G-CSF抑制了ICH 大鼠Ast過度膠質(zhì)化，可增強對神經(jīng)細胞的保護作用，減輕對腦組織的損傷作用，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但是怎樣才能使GFAP 恰好維持在一個適當?shù)乃綇亩畲蟪潭劝l(fā)揮Ast的神經(jīng)保護作用以及G-CSF抑制Ast過度活化的機制有待進一步研究。

［1］Laske C，Stellos K，Stransky E，et al.Decreased plasma levels of granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）in patients with early Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2009，17（1）：115-23.

［2］Sevimli S，Diederich K，Strecker JK，et al.Endogenous brain protection by granuloeyte-colony stimulating factor after ischemic stroke［J］.Exp Neurol，2009，217（2）：328-335.

［3］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［4］Garcia JH，Wagner S，Liu KF，et al.Neurolgical deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rars statistical validation［J］.Stroke，1995，26（4）：627-634.

［5］Corti S，Locatelli F，Strazzer S，et al.Modulated generation of neuronal cells from bone marrow by expansion and mobilization of circulating stem cells with in vivo cytokine treatment［J］.Exp Neurol，2002，177（2）：443-452.

［6］Sch bitz WR，Kollmar R，Schwaninger M，et al.Neuroprotective effect of granulocyte colony-stimulating factor after focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2003，34（3）：745-751.

［7］Schneider A，Krüger C，Steigleder T，et al.The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis［J］.J Clin Invest，2005，115（8）：2 083-2 098.

［8］Hasselblatt M，Jeibmann A，Riesmeier B，et al.Granuloeyte colony stimulating factor（G-CSF）and G-CSF receptor expression in human ischemie stroke［J］.Acta Neuropathol，2007，113（l）：45-51.

［9］Solaroglu I，Cahill J，Tsubokawa T，et al.Granulocyte colony-stimulating factor protects the brain against experimental stroke via inhibition of apoptosis and inflammation［J］.Neurol Res，2009，31（2）：167-172.

［10］Sugiyama Y，Yagita Y，Oyama N，et al.Granulocyte colonystimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke［J］.Stroke，2011，42（3）：770-775.

［11］England TJ，Abaei M，Auer DP，et al.Granulocyte colonystimulating factor for mobilizing bone marrow stem cells in subacute stroke：the stem cell trial of recovery enhancement after stroke-randomized controlled trial［J］.Stroke，2012，43（2）：405-411.

［12］Barker AJ，Ullian EM.Astrocytes and synaptic plasticity［J］.Neuroscientist，2010，16（1）：40-50.

［13］Love S，McLean C.Overview and recent advances in neuropathology［J］.Pathology，2011，43（2）：87.

［14］Brouns R，De Vil B，Cras P，et al.Neurobiochemical markers of brain damage in cerebrospinal fluid of acute ischemic stroke patients［J］.Clin Chem，2010，56（3）：451-458.

［15］梁彥濤，張敬軍.膠原纖維酸性蛋白基礎(chǔ)與臨床研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2009，15（16）：2 407-2 409.

［16］Komine-Kobayashi M，Zhang N，Liu M，et al.Neuroprotective effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in transient focal ischemia of mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（3）：402-413.

［17］Masuda T，Maki M，Hara K，et al.Peri-hemorrhagic degeneration accompanies stereotaxic collagenase-mediated cortical hemorrhage in mouse［J］.Brain Res，2010，1 355：228-239.