郭 靜 勾向博 張文麗 李琪佳 王志強(qiáng)

(河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，②附屬醫(yī)院骨科 河北唐山 063000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，由多種因素引起的多發(fā)于老年人的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，以緩慢進(jìn)行性的關(guān)節(jié)軟骨破壞為主要病理特征，好發(fā)于負(fù)重較大的膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱及手指等部位，其中膝關(guān)節(jié)OA是老年人群中最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎類型，也是導(dǎo)致老年人疼痛和殘疾的首要病因。國(guó)外學(xué)者多項(xiàng)研究表明:p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)與核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在OA的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，OA時(shí)由軟骨和滑膜分泌的大量炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α等可以通過(guò)p38MAPK、NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活而誘導(dǎo)炎性介質(zhì)如iNOS、COX-2 及 MMP-1、MMP-9、MMP-13 等金屬蛋白酶的基因表達(dá)［1］。p38可分為激活狀態(tài)和非激活狀態(tài)，一般情況下在同種組織中p38的總蛋白含量相對(duì)保守，而它的激活狀態(tài)的增加也即P-p38的含量增加代表了p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活。NF-κB家族成員之間可形成一系列同源或異源二聚體，典型的NF-κB是由p65和p50兩個(gè)亞基組成。本研究通過(guò)觀察膝關(guān)節(jié)OA軟骨與滑膜組織中P-p38、NF-κB p65蛋白的表達(dá)及分布特點(diǎn)，了解二者在OA發(fā)生發(fā)展中的作用及相互關(guān)系，為OA發(fā)病機(jī)制和治療研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取唐山市骨科醫(yī)院行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)60例OA患者自愿捐贈(zèng)的軟骨與滑膜標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，其中男24例，女36例，平均(66．3±8．4)歲;另取20例因交叉韌帶斷裂、盤(pán)狀軟骨損傷等行手術(shù)治療的患者自愿捐贈(zèng)的軟骨與滑膜標(biāo)本，男16例，女4例，平均(32．8±7．6)歲，經(jīng)病理學(xué)診斷膝關(guān)節(jié)無(wú)病變，作為正常對(duì)照組。全部新鮮標(biāo)本術(shù)后1h內(nèi)均用生理鹽水沖洗，切成1．0cm×0．8cm×0．5cm小塊，以10%中性甲醛固定48h，關(guān)節(jié)軟骨以10%EDTA脫鈣6、7周，每周更換脫鈣液1次，脫鈣滿意后常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，以4～5μm厚度連續(xù)切片，備份HE及免疫組織化學(xué)染色。

1．2 方法 P-p38多克隆抗體濃縮液、NF-κB p65多克隆抗體濃縮液購(gòu)自武漢博士德公司，即用型Elivision免疫組化兩步法檢測(cè)試劑盒、棕黃色DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色。

1．3 判定標(biāo)準(zhǔn) 采用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)對(duì)各組免疫組化結(jié)果進(jìn)行積分光密度(integral optical density，IOD)值檢測(cè)及分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)，每個(gè)視野中選擇1個(gè)具有代表的陽(yáng)性細(xì)胞中棕黃色顆粒進(jìn)行標(biāo)記，以此標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)檢測(cè)所有視野的陽(yáng)性細(xì)胞，以參數(shù)平均IOD值代表蛋白的顆粒密度。并計(jì)算每個(gè)高倍視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，按其陽(yáng)性細(xì)胞分布范圍計(jì)算百分率:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例小于5%計(jì)為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞占5% ～25%為(+);陽(yáng)性細(xì)胞占25% ～50%為(■);陽(yáng)性細(xì)胞占50%以上為(■)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用表示，組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn);將實(shí)驗(yàn)組P-p38、NF-κB p65蛋白表達(dá)的IOD值進(jìn)行Pearson直線相關(guān)分析。以P＜0．05確定為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 P-p38 實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等胞核均有P-p38表達(dá)，其中軟骨中尤以固縮變性的軟骨細(xì)胞為重，在滑膜主要分布于襯里層的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞及淋巴細(xì)胞胞核內(nèi)。對(duì)照組僅在軟骨表層及滑膜襯里層細(xì)胞有少量表達(dá)，但染色強(qiáng)度較低。圖像分析顯示，實(shí)驗(yàn)組P-p38蛋白表達(dá)的IOD值為(11．35±3．39)，高于對(duì)照組的(3．28 ±1．19)(P＜0．01)。兩組 P-p38 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，見(jiàn)表1。

2．2 NF-κB 實(shí)驗(yàn)組各層軟骨細(xì)胞、增生的滑膜襯里層細(xì)胞及襯里下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)均可見(jiàn)大量的NF-κB強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其中以胞核著色為主，多呈團(tuán)塊狀分布。對(duì)照組軟骨與滑膜的陽(yáng)性細(xì)胞分布與實(shí)驗(yàn)組相似，但表達(dá)較少，且以胞質(zhì)著色為主。圖像分析顯示，實(shí)驗(yàn)組NF-κB p65蛋白表達(dá)的 IOD值為(11．86±3．15)，高于對(duì)照組的(3．72±1．06)(P＜0．01)。兩組 NF-κB p65 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，見(jiàn)表1。

表1 P-p38、NF-κB 在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率的比較(%)

2．3 實(shí)驗(yàn)組P-p38與NF-κB表達(dá)的關(guān)系 相關(guān)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組P-p38蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)成正相關(guān)(r=0．426，P＜0．01)。

3 討論

OA的病因?qū)W主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是關(guān)節(jié)軟骨破壞導(dǎo)致軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性改變，使軟骨細(xì)胞釋放多種酶類、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子;二是OA中關(guān)節(jié)軟骨在致病因素作用下被破壞后，釋放碎片進(jìn)入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎癥反應(yīng)，致使滑膜細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步降解軟骨，周而復(fù)始造成惡性循環(huán)。

p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路屬于MAPK家族中的應(yīng)激活化蛋白激酶，是一種分布于胞漿中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起核內(nèi)反應(yīng)的通道之一。p38靜息狀態(tài)主要分布于細(xì)胞漿，可被多種刺激因子激活，激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)效應(yīng)基因的表達(dá)，在細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用［2］。Joos等［3］人研究發(fā)現(xiàn)，多種p38MAPK抑制劑均能夠顯著地抑制IL-1β誘導(dǎo)的人OA軟骨細(xì)胞中COX-2、iNOS、MMP-13及PGE2等炎性介質(zhì)的基因表達(dá)。膝OA模型大鼠的研究同樣證明了關(guān)節(jié)軟骨中p38MAPK被激活，并且其抑制劑SB203580能夠明顯地降低軟骨細(xì)胞凋亡與Ⅱ型膠原的降解以及抑制MMP-3、MMP-13的表達(dá)，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，延緩OA進(jìn)程。表明p38MAPK信號(hào)途徑在OA的病程中起著重要作用［4］。又有研究表明，NO可以通過(guò)激活p38MAPK誘導(dǎo)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡［5］;膝關(guān)節(jié)OA患者的軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)由Fas途徑介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡同樣依賴于p38MAPK的活性［6］。因?yàn)镹O途徑和Fas途徑是介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的兩個(gè)最重要的途徑，因此推測(cè)p38MAPK信號(hào)途徑的激活與OA軟骨細(xì)胞凋亡也有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OA組P-p38蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組;兩組中P-p38蛋白表達(dá)IOD值分別為(11．35 ±3．39)和(3．28 ±1．19)，與對(duì)照組相比，OA組軟骨與滑膜組織中P-p38表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。并且，我們發(fā)現(xiàn)P-p38蛋白在OA軟骨基質(zhì)纖維化嚴(yán)重區(qū)域內(nèi)退變的軟骨細(xì)胞胞核內(nèi)呈強(qiáng)烈表達(dá)。結(jié)合本研究數(shù)據(jù)認(rèn)為，p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在人膝關(guān)節(jié)OA軟骨和滑膜組織中被激活，可能促進(jìn)OA軟骨的進(jìn)行性破壞。

NF-κB是由Sen等在1986年首先應(yīng)用凝膠電泳遷移率多肽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞核提取物中一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的蛋白因子，稱之為NF-κB。正常情況下常與其抑制性蛋白(IκB)結(jié)合而呈非活性狀態(tài)?？杀籘NF-α、IL-1、蛋白激酶C激活劑、氧化劑、自由基等多種刺激因素激活，激活的NF-κB與其抑制性蛋白解離，從胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，與DNA上靶基因上游的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［7］。Csaki等［8］研究表明，白藜蘆醇和姜黃素對(duì)人關(guān)節(jié)軟骨的協(xié)同保護(hù)作用是通過(guò)抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡。Isabel等［9］研究發(fā)現(xiàn)，OA患者滑膜組織中過(guò)度表達(dá)的高遷移率族蛋白B1能夠作為炎性細(xì)胞因子而加強(qiáng)OA滑膜的炎性過(guò)程;并且可以與IL-1β協(xié)同刺激滑膜細(xì)胞p38MAPK、NF-κB等信號(hào)通路活化，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性損壞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OA組關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中NF-κB蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞彌漫性分布于各層軟骨細(xì)胞、增生的滑膜襯里層細(xì)胞以及襯里下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎細(xì)胞等。因此本實(shí)驗(yàn)證明:人膝關(guān)節(jié)OA軟骨和滑膜中NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同樣是被激活的。

本研究相關(guān)分析顯示，OA組P-p38與NF-κB蛋白表達(dá)之間存在明顯的正相關(guān)，提示P-p38的增加可能進(jìn)一步引起NF-κB的表達(dá)增加，NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，有可能被p38MAPK激活，但仍需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。同時(shí)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，p38MAPK與NF-κB信號(hào)通路之間可能存在著串話。

綜上所述，p38MAPK與NF-κB信號(hào)通路在OA關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中被高度激活并呈明顯正相關(guān)，二者在OA的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。然而，OA的病理發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的并受多種信號(hào)通路影響的過(guò)程，它不受任一信號(hào)通路(包括p38MAPK和NF-κB)單獨(dú)調(diào)節(jié)。在任何時(shí)候關(guān)節(jié)軟骨和滑膜細(xì)胞內(nèi)都有大量信號(hào)通路的激活，各信號(hào)通路之間的相互串話、正負(fù)反饋循環(huán)以及大量信號(hào)整合的結(jié)果決定軟骨細(xì)胞最后的反應(yīng)(包括軟骨細(xì)胞的合成代謝、分解代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等)。因此，對(duì)p38MAPK與NF-κB信號(hào)通路和OA的相關(guān)性進(jìn)行深入探討，可以為解釋OA的發(fā)病機(jī)制及病理過(guò)程提供幫助，并且為OA的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

［1］ Kapoor M，Martel-Pelletier J，Lajeunesse D，et al．Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis［J］．Nat Rev Rheumatol，2011，7(1):33

［2］ Rasheed Z，Akhtar N，Haqqi TM．Pomegranate extract inhibits the in-terleukin-1β -induced activation of MKK-3，p38α -MAPK and transcription factor RUNX-2 in human osteoarthritis chondrocytes［J］．Arthritis Res Ther，2010，12(5):R195

［3］ Joos H，albrecht W，Laufer S，et al．Differential effects of p38MAP kinase inhibitors on the expression of inflammation-associated genes in primary，interleukin-1beta-stimulated human chondrocytes［J］．Br J Pharmacol，2010，160(5):1252

［4］ Brown KK，Heitmeyer SA，Hookfin EB，et al．P38 MAP kinase inhibitors as potential therapeutics for the treatment of joint degeneration and pain associated with osteoarthritis［J］．J Inflamm，2008，5:22

［5］ Kim SJ，Ju JW，Oh CD，et al．ERK-1/2 and p38 kinase oppositely regulate nitric oxide-induced apoptosis of chondrocytes in association with p53，caspase-3，and differentiation status［J］．J Biol Chem，2002，277(2):1332

［6］ Wei L，Sun XJ，Wang Z，et al．CD95-induced osteoarthritic chondrocyte apoptosis and necrosis:dependency on p38 mitogen-activated protein kinase［J］．Arthritis Res Ther，2006，8(2):R37

［7］ Simmonds RE，F(xiàn)oxwell BM．Signalling，inflammation and arthritis:NF-kappaB and its relevance to arthritis and inflammation［J］．Rheumatology，2008，47(5):584

［8］ Csaki C，Mobasheri A，Shakibaei M．Synergistic chondroprotective effects of curcumin and resveratrol in human articular chondrocytes:inhibition of IL-1beta-induced NF-kappaB-mediated inflammation and apoptosis［J］．Arthritis Res Ther，2009，11(6):R165

［9］ Garcia-Arnandis I，Guillen MI，Gomar F，et al．High mobility group box 1 potentiates the pro-inflammatory effects of interleukin-1β in osteoarthritic synoviocytes［J］．Arthritis Res Ther，2010，12(4):R165