龐磊　張躍蓉　劉忠林

[摘要] 目的 觀察不同濃度的雌激素作用于體外培養(yǎng)的人胚髁突軟骨細(xì)胞（MCCs），探討雌激素對(duì)MCCs增殖分化的影響。方法 體外培養(yǎng)MCCs，甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定；甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)不同濃度雌激素對(duì)MCCs增殖與分化的影響。結(jié)果 高濃度（10-6 mol·L-1）、低濃度（10-12 mol·L-1）雌二醇抑制MCCs增殖分化，生理濃度（10-10、10-8 mol·L-1）雌二醇促進(jìn)MCCs增殖分化，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，促進(jìn)或抑制作用增強(qiáng)。結(jié)論 雌激素對(duì)體外培養(yǎng)的人胚M(jìn)CCs增殖分化具有雙向調(diào)節(jié)作用，呈時(shí)間和劑量依賴性。表明雌激素對(duì)維持顳下頜關(guān)節(jié)的正常功能具有重要意義，可能在顳下頜關(guān)節(jié)病的發(fā)生和進(jìn)程中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 髁突軟骨細(xì)胞； 雌激素； 增殖； 人胚

[中圖分類號(hào)] Q 254 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.020

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular joints disorder，TMD）是口腔頜面部常見病、多發(fā)病，病因復(fù)雜[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病存在明顯的性別差異，以女性高發(fā)，且患病集中在青春期和絕經(jīng)期[3-4]，推測(cè)雌激素與TMD的發(fā)病可能有一定關(guān)系。髁突軟骨細(xì)胞（mandibular condylar chondro-cytes，MCCs）具有類似間充質(zhì)細(xì)胞的作用，其增殖分化直接調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雌激素影響長(zhǎng)骨和顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的增殖分化[5-7]，而探究雌激素對(duì)人MCCs作用的報(bào)道甚少。本研究選用17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）干預(yù)體外培養(yǎng)的人胚M(jìn)CCs，從而了解雌激素對(duì)人胚M(jìn)CCs生長(zhǎng)代謝的影響，為進(jìn)一步揭示雌激素與TMD的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1.1 標(biāo)本 選取遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院計(jì)生科提供的因母體健康原因水囊引產(chǎn)并自愿捐獻(xiàn)的4～5月齡胚胎。實(shí)驗(yàn)通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和同意。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體、通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、山羊血清封閉液、胃蛋白酶消化液、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），改良的高糖Eagle培養(yǎng)基（high glucose Dulbeccos modified Eagle medium，HG-DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），Ⅱ型膠原酶、E2（Sigma公司，美國），胎牛血清（fe-tal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國）。

倒置相差顯微鏡（IX71）、Image-Pro Express6.0成像系統(tǒng)（Olympus公司，日本），二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 人胚M(jìn)CCs的原代培養(yǎng)與純化 無菌條件下取出雙側(cè)髁突，仔細(xì)剝離去除髁突軟骨表面的纖維組織，切取呈半透明的軟骨中間部分，PBS清洗，反復(fù)剪切至1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃振蕩消化30 min；37 ℃ 0.1%Ⅱ型膠原酶消化2 h，150目篩網(wǎng)過濾，用含20%FBS的HG-DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升5×105個(gè)，然后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。生長(zhǎng)至第8天時(shí)，差速貼壁3次去除成纖維細(xì)胞，純化后計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為每毫升5×105個(gè)時(shí)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 人胚M(jìn)CCs傳代培養(yǎng)及細(xì)胞爬片制備 原代細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含10%FBS培養(yǎng)基制成濃度為每毫升5×105個(gè)的細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，每3 d更換1次培養(yǎng)液。收集第1代細(xì)胞，加培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升

5×104個(gè)，接種于已預(yù)先放置滅菌處理蓋玻片的六孔板中。細(xì)胞60%融合時(shí)，固定于載玻片上。4%預(yù)冷丙酮中固定15 min，PBS漂洗，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 人胚M(jìn)CCs的形態(tài)學(xué)觀察 取已制備好的MCCs爬片，PBS漂洗，蘇木精染色4 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，流水沖洗，溫水返藍(lán)后，伊紅復(fù)染3 min，常規(guī)脫水、透明后中性樹膠封固。

1.2.4 人胚M(jìn)CCs的鑒定 1）甲苯胺藍(lán)染色：PBS漂洗細(xì)胞爬片，0.1%甲苯胺藍(lán)染色15 min，水洗10 min，常規(guī)脫水、透明后中性樹膠封固。2）Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色：在細(xì)胞爬片上，滴加0.3%Triton-X100作用20 min；再滴加3%過氧化氫避光孵育15 min，胃蛋白酶室溫消化20 min，山羊血清室溫封閉30 min；滴加鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（一抗），對(duì)照組加PBS，4 ℃過夜；次日，滴加通用型二抗50 μL，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，常規(guī)脫水透明后封固。

1.2.5 繪制人胚M(jìn)CCs的生長(zhǎng)曲線 收集第2代單層軟骨細(xì)胞，細(xì)胞濃度為每毫升2×104個(gè)，每孔1 mL接種于24孔培養(yǎng)板。每日隨機(jī)取3孔，每孔計(jì)數(shù)3次，取3孔細(xì)胞數(shù)平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果，連續(xù)計(jì)數(shù)8 d。

以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞濃度為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析第2代細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.6 雌激素對(duì)人胚M(jìn)CCs增殖分化的影響 依E2濃度的不同將實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為10-12 mol·L-1組、10-10 mol·L-1組、10-8 mol·L-1組、10-6 mol·L-1組、0 mol·L-1（乙醇溶劑對(duì)照組），實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基將E2稀釋成所需濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第2代MCCs，制成濃度為每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL，并將96孔板周邊的36孔用滅菌PBS填充，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行同步化處理，抽去舊培養(yǎng)基，換不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。抽去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL不同濃度的E2，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)組每孔加入甲基噻唑基四唑（methyl thiazdyl tetrazolium，MTT）（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，吸去上清液后，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。在預(yù)熱后的酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm，測(cè)定各孔光密度值（optical density，OD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，并用LSD方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 原代人胚M(jìn)CCs的形態(tài)

原代細(xì)胞接種1 d后完成鋪伸；接種第5天細(xì)胞相互融合，密度為40%；接種第7天細(xì)胞偽足伸長(zhǎng)，相連成片，成簇聚集，細(xì)胞密度達(dá)50%；接種第13天細(xì)胞排列緊密，融合達(dá)到80%（圖1）。

2.2 傳代人胚M(jìn)CCs的形態(tài)觀察

原代細(xì)胞培養(yǎng)至12～13 d第1次傳代。傳代培養(yǎng)的MCCs接種后6～8 h開始貼壁，第3～5天快速增殖，呈鋪路石狀（圖2左），細(xì)胞伸出偽足相互融合，第7天細(xì)胞密度達(dá)到80%（圖2右）。

2.3 人胚M(jìn)CCs的蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，

HE）染色結(jié)果

人胚M(jìn)CCs主要呈三角形、多角形，細(xì)胞質(zhì)均勻豐富，染成淺紅色；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，染成淺藍(lán)色，偏向細(xì)胞一側(cè)，可見1～2個(gè)染成深藍(lán)色的核仁（圖3）。

2.4 人胚M(jìn)CCs的鑒定結(jié)果

甲苯胺藍(lán)染色后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見均勻的紫藍(lán)色異染基質(zhì)，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，結(jié)果為陽性（圖4左）。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，細(xì)胞質(zhì)中可見片狀或團(tuán)塊狀棕黃色顆粒，細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色，結(jié)果陽性，陽性率達(dá)95%（圖4右）。

2.5 第二代人胚M(jìn)CCs的生長(zhǎng)曲線

傳代1 d后MCCs重新貼壁，生長(zhǎng)緩慢，少數(shù)細(xì)胞未能貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目有損失，細(xì)胞生長(zhǎng)處于起始期；第2天開始，細(xì)胞適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)入快速增殖期；第3～4天細(xì)胞生長(zhǎng)速度極快，細(xì)胞數(shù)目成倍增長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線陡然上升，細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期；第5～7天增殖速度減慢，第8天細(xì)胞增殖趨于平緩，進(jìn)入平臺(tái)期（圖5）。

2.6 雌激素對(duì)MCCs增殖分化的影響

雌二醇對(duì)MCCs增殖分化的影響見表1。MTT法比色結(jié)果顯示：10-6 mol·L-1組、10-12 mol·L-1組作用后OD值均低于對(duì)照組（P<0.05），且10-6 mol·L-1組OD值明顯低于10-12 mol·L-1組（P<0.05），表明高濃度與低濃度E2均可抑制髁突MCCs的增殖與分化，高濃度抑制作用更強(qiáng)。10-10 mol·L-1組、10-8 mol·L-1組作用后OD值均高于對(duì)照組（P<0.05），且10-8 mol·L-1組OD值高于10-10 mol·L-1組（P<0.05），表明相當(dāng)于生理濃度的E2可促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，且10-8 mol·L-1 E2促進(jìn)作用最強(qiáng)。E2作用48、72 h，10-6 mol·L-1組OD值持續(xù)下降（P<0.05），作用72 h降至最低（P<

0.05）；對(duì)照組OD值持續(xù)升高（P<0.05），72 h達(dá)到頂峰（P<0.05）；作用48 h，10-12 mol·L-1組OD值低于對(duì)照組（P<0.05），高于加藥后24 h同濃度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該濃度作用48 h抑制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制作用并未完全抵消細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增殖活力，到72 h OD值明顯下降（P<0.05），隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度E2抑制了髁突軟骨細(xì)胞的增殖分化。以上結(jié)果表明，E2對(duì)髁突軟骨細(xì)胞增殖分化的影響隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，效應(yīng)更顯著。

3 討論

TMD病因復(fù)雜，幾乎所有與顳下頜關(guān)節(jié)的組成結(jié)構(gòu)、咀嚼肌系統(tǒng)、鄰近組織的改建、骨關(guān)節(jié)的炎性病變等相關(guān)的因素都有可能誘發(fā)TMD[1]。臨床資料顯示女性TMD患病率明顯高于男性，女性患病年齡集中在15～20歲和45～55歲，這兩個(gè)年齡段分別與青春期、絕經(jīng)期吻合[4]。TMD存在性別和年齡的差異，提示雌激素與TMD有關(guān)，其水平的高低變化可能會(huì)影響TMD的進(jìn)程。

雌激素是類固醇激素，分泌入血后與性激素結(jié)合球蛋白可逆性結(jié)合，游離的雌激素?cái)U(kuò)散到靶組織中發(fā)揮其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)中存在有雌激素受體的表達(dá)。Wang等[11]進(jìn)一步提取到了體外培養(yǎng)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)MCCs的雌激素受體總蛋白，從而證明顳下頜關(guān)節(jié)是雌激素作用的靶器官，雌激素受體可介導(dǎo)雌激素對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)的作用[12]。

以往國內(nèi)外學(xué)者主要在動(dòng)物模型上探討雌激素對(duì)軟骨細(xì)胞代謝的影響，Talwar等[13]證實(shí)10-8 mol·L-1雌二醇可抑制大鼠對(duì)數(shù)期髁突軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)肥大軟骨層Ⅹ型膠原的合成分泌，使得軟骨細(xì)胞外基質(zhì)厚度增加，軟骨細(xì)胞層數(shù)減少，影響髁突軟骨發(fā)育成熟。Yun等[6]發(fā)現(xiàn)不同濃度雌激素可誘導(dǎo)大鼠髁突軟骨不同炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)生。邵樂南等[14]研究發(fā)現(xiàn)高濃度（10-6 mol·L-1）雌二醇對(duì)兔的髁突軟骨細(xì)胞增殖有顯著地抑制作用，生理濃度（10-10～10-8 mol·L-1） 雌二醇促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，其最大效應(yīng)也是在濃度為10-8 mol·L-1。張旻等[15]的研究卻顯示出不同的結(jié)果，高濃度（10-6 mol·L-1）雌二醇對(duì)兔的髁突軟骨細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。以上的研究都提示了雌激素水平的高低可影響髁突軟骨細(xì)胞的代謝，從而影響軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，導(dǎo)致軟骨層厚度的改變，進(jìn)而引發(fā)TMD的骨關(guān)節(jié)炎性病變；但學(xué)者們就雌激素是促進(jìn)動(dòng)物髁突軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)還是抑制其生長(zhǎng)的問題上出現(xiàn)了分歧。為進(jìn)一步查明雌激素對(duì)人類髁突軟骨細(xì)胞增殖分化的影響，本實(shí)驗(yàn)采用體外分離培養(yǎng)人胚M(jìn)CCs，不同濃度雌激素的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察雌激素對(duì)人胚M(jìn)CCs增殖與分化的影響，為進(jìn)一步揭示雌激素與TMD的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

髁突軟骨是纖維軟骨，其軟骨層細(xì)胞主要功能是合成和分泌Ⅱ型膠原[16]，目前基于軟骨的組成多用酶消化法獲取軟骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用張躍蓉等[17]使用的改良兩步酶消化法，膠原酶消化液用高糖培養(yǎng)基配制，這既增加組織塊與酶的接觸面積，充分發(fā)揮酶的消化作用，又減少了酶對(duì)游離細(xì)胞的損傷，并采用差速貼壁法消除成纖維細(xì)胞的污染，進(jìn)而獲得高活性、高增殖力均一的髁突軟骨細(xì)胞。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的描述，準(zhǔn)確反映了細(xì)胞的生長(zhǎng)情況[18]，不同生長(zhǎng)期的細(xì)胞特性不同，因此細(xì)胞生長(zhǎng)周期的測(cè)定對(duì)于確定傳代時(shí)間以及選擇藥物實(shí)驗(yàn)干預(yù)方案顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)觀察到第2代髁突MCCs于接種后3～4 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞活力最旺盛；第6天開始，細(xì)胞相互接觸產(chǎn)生接觸抑制，數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定；之后細(xì)胞相互聚集，停止增殖，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)開始產(chǎn)生空泡，形態(tài)改變，直至脫落死亡；因此，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期確定第二代MCCs生長(zhǎng)的第3～4天為實(shí)驗(yàn)干預(yù)的最佳時(shí)期。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高濃度（10-6 mol·L-1）、低濃度（10-12 mol·L-1）的E2抑制MCCs的增殖，其中高濃度抑制作用最強(qiáng)；生理濃度（10-10、10-8 mol·L-1） E2能促進(jìn)MCCs的增殖，10-8 mol·L-1 E2促進(jìn)作用更強(qiáng)。隨著雌激素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，E2對(duì)MCCs的促進(jìn)及抑制作用加強(qiáng)；這與邵樂南等[14]的研究結(jié)果一致。綜合流行病學(xué)資料，女性易發(fā)TMD，且患病集中在青春期和絕經(jīng)期相，因此，筆者推測(cè)雌激素對(duì)人MCCs增殖分化作用并不是單純的促進(jìn)或抑制，而是具有雙向調(diào)節(jié)作用，并呈現(xiàn)出時(shí)間、劑量的依賴性，即生理濃度雌激素促進(jìn)髁突軟骨的增殖，對(duì)維持顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)代謝的平衡和正常功能具有非常重要的作用；而高濃度、低濃度雌激素均抑制髁突軟骨增殖，使髁突軟骨代謝失衡，從而引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎性病變，導(dǎo)致TMD的發(fā)生。

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（本文編輯 杜冰）