張景華 王保信 汪 萍 張德才

細胞增殖抑制基因(hyperplasic suppress gene,HSG)是由我國學者陳光慧利用差異顯示技術(shù)從正常血壓和高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中發(fā)現(xiàn)的1個新基因。因其對血管平滑肌等多種細胞的增殖有抑制作用，故被命名為增殖抑制基因。研究證實HSG對多種腫瘤傳代細胞系同樣也具有明顯的生長抑制和誘導凋亡的作用。HSG表達的降低是細胞增生的1個重要機制，可能參與腫瘤的發(fā)生過程。

EGFR是表皮生長因子受體家族中4個成員之一。它是1個170 Dk的跨膜糖蛋白，由細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)組成，屬于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體。該受體與相應(yīng)配體結(jié)合成二聚體，激活其固有的酪氨酸激酶活性，磷酸化自身酪氨酸殘基，從而活化EGFR。EGFR基因的過度表達已證明與細胞的惡變有關(guān)。本實驗應(yīng)用免疫組織化學方法檢測HSG、EGFR在人乳腺癌組織、乳腺腺瘤組織、正常乳腺組織中的表達以及它們之間的關(guān)系，以期為乳腺癌的預(yù)后判斷和治療提供一些新的參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集唐山市人民醫(yī)院2008年10月～2009年3月經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌組織標本45例，正常乳腺組織標本30例和乳腺纖維腺瘤組織標本30例，均為女性，年齡33～72歲，平均年齡48歲。45例乳腺癌中浸潤性導管癌39例，浸潤性小葉癌3例，導管內(nèi)癌2例，髓樣癌1例。腫瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ期18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性21例，陰性24例。所有標本均經(jīng)病理檢查確診。乳腺癌標本術(shù)前均未接受放療、化療治療，術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)有遠處轉(zhuǎn)移病灶。

1.2 試劑與方法

標本用10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，采用免疫組化SP法，染色步驟嚴格按試劑盒要求進行，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照，以乳腺癌陽性片作為陽性對照。應(yīng)用免疫組織化學方法來檢測HSG、EGFR在人乳腺癌組織、腺瘤組織、正常乳腺組織中的表達。HSG鼠抗人單克隆抗體購于美國 SANTA CRUZ公司，EGFR小鼠抗人多克隆抗體購于武漢博士德生物公司。免疫組化染色試劑盒SP-9000、DAB顯色液、PBS磷酸鹽緩沖液等均購于北京中杉金橋生物公司。

1.3 結(jié)果判斷

以細胞質(zhì)、細胞膜中有棕黃色顆粒為陽性細胞。參照國外學者[1]評判標準：無陽性細胞或陽性細胞數(shù)<10%為(﹣)；陽性細胞數(shù)為10%～50%記為(+)；陽性細胞數(shù)為51%～75%記為(++)；陽性細胞數(shù)>75%記為(+++)。陽性細胞數(shù)≥10%的病例均視為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件分析系統(tǒng)進行χ2檢驗、Spearman 等級相關(guān)性檢驗。P<0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HSG、EGFR在乳腺組織中的表達

HSG的蛋白主要在細胞胞質(zhì)中表達，陽性表達時呈現(xiàn)大小不等的棕黃色(黃色)顆粒。HSG在正常乳腺組織中的陽性表達率為83.3%(25/30)，在乳腺纖維腺瘤組織中的陽性表達率為76.7%(23/30)，在乳腺癌組織中的陽性表達率為35.6%(16/45)，乳腺癌組織HSG的陽性率較乳腺纖維腺瘤組織、正常乳腺組織均具有統(tǒng)計學差異(χ2=12.188，P<0.05 ；χ2=16.580，P<0.05)。

EGFR主要在細胞質(zhì)、細胞膜表達，在正常乳腺組織中的陽性表達率為26.7%(8/30)，在乳腺纖維腺瘤組織中的陽性表達率為23.3%(7/30)，在乳腺癌組織中的陽性表達率為60.0%(27/45)。乳腺癌組織中EGFR的陽性率較乳腺纖維腺瘤組織、正常乳腺組織均具有統(tǒng)計學差異(χ2=9.765，P<0.05 ；χ2=8.036，P<0.05)。

2.2 HSG、EGFR在乳腺癌中的陽性表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

HSG蛋白陽性率在乳腺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=4.683，P<0.05)；不同病理分級的乳腺癌中HSG陽性率差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.823，P<0.05)，其中Ⅰ、Ⅱ級的表達率高于Ⅲ級；在ER、 H-erb-2陽性的乳腺癌中HSG的陽性表達率明顯高于ER、 H-erb-2陰性的，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.008，P=0.005；χ2=5.614，P=0.018)。 HSG的表達與腫瘤類型、腫瘤大小、臨床分期、年齡等無明顯關(guān)系(P>0.05)。

EGFR蛋白陽性率在乳腺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=4.301,P=0.038)；不同病理分級的乳腺癌中EGFR陽性率差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=3.951，P=0.047)，其中Ⅰ、Ⅱ級的表達率低于Ⅲ級。在ER、 H-erb-2陽性的乳腺癌中EGFR的陽性表達率明顯高于ER、 H-erb-2陰性的，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.202,P=0.007；χ2=5.559,P=0.018)。EGFR蛋白陽性率與腫瘤類型、腫瘤大小、臨床分期、年齡、PR等無明顯關(guān)系(P>0.05)，見表1。

2.3 乳腺癌組織中HSG與EGFR表達的相關(guān)性

在乳腺癌組織中HSG的表達與EGFR的表達呈負相關(guān)，Spearman等級相關(guān)系數(shù)γ=-0.531,P=0.000，見表2。

表1 HSG、EGFR在乳腺癌中的陽性表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系(例，%)

表2 乳腺癌患者HSG與EGFR表達相關(guān)性(例)

3 討論

增殖抑制基因(HSG)是我國學者陳光慧等在1997年利用差異顯示技術(shù)對正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的cDNA文庫進行篩選時分離得到的1個新基因，該cDNA的長度為4160 bp,可編碼757個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為62644[2]。人的HSG(hHSG)定位于1號染色體短臂36.3位置上，此區(qū)域為許多腫瘤的突變高發(fā)區(qū)[3]。陳光慧等發(fā)現(xiàn)HSG在抗細胞增殖方面具有重要作用[4]，HSG的表達增強會使細胞周期蛋白E和細胞周期蛋白E-CDK2復(fù)合物的表達下降，細胞停滯在G0/G1期，不能向S期轉(zhuǎn)換，抑制了細胞的增殖。實驗表明,腺病毒轉(zhuǎn)染的rHSG在一系列癌細胞系中,尤其是1種胸腺癌細胞系BM-1中具有強大的抗增殖作用。而且人HSG比已知的腫瘤抑制因子p53介導的抗腫瘤細胞增殖的作用更強大。研究還發(fā)現(xiàn)HSG能夠通過抑制Ras-Raf-ERK-MAPK途徑來阻遏細胞周期和抑制細胞的增殖。HSG對大鼠血管平滑肌細胞(rat vascular smooth muscle cell,rVSMC)增殖的抑制作用是通過Ras-Raf-MEK-ERK1/2信號通路來實現(xiàn)的。人們也發(fā)現(xiàn)HSG與Ras相互作用后，同樣抑制了Raf和ERK1/2信號通路的活性。Santel 等[5]發(fā)現(xiàn)HSG上有1個高度保守的ras共有模體(N-DVKGYLSKVRGISEVL-C),它在抗增殖和抑制ERK1/2信號通路中具有重要作用。而剔除了p21ras的HSG即喪失了抑制ERK1/2磷酸化和抑制細胞生長的作用。

EGFR (epidermal growth factor receptor)廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞膜上，分為酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(TKD)和羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)兩部分，未被激活時均以單體形式存在[6,7]。EGFR信號轉(zhuǎn)導通路是G-蛋白、細胞因子受體、整合素等多種信號通路的交匯點，其活化能介導細胞的生長、增殖、分化、粘附以及移動等生命活動，在機體的發(fā)育過程中起重要作用[8]。EGFR及其配體EGF啟動的最重要的信號轉(zhuǎn)導途徑是Ras-Raf-MAPK途徑，其對細胞生長、增殖、發(fā)育分化及癌細胞產(chǎn)生起重要作用[9]，同時該途徑可被細胞增殖抑制基因(HSG)抑制，從而使EGFR的表達下調(diào)。EGFR高表達可促進腫瘤細胞的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移以及血管生成，抑制腫瘤細胞的凋亡，進而促進腫瘤的進展[10,11]。Nicholson 等[12]發(fā)現(xiàn)EGFR高表達的腫瘤患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)時間短、復(fù)發(fā)率高、存活期短等。郎榮剛等[13]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中EGFR表達陽性率為 61.54%,表達陽性者腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、生存率低 (P<0.05 )。在有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,EGFR表達陰性者生存率高 (P<0.01),對腋淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者,EGFR檢測有助于評估其中預(yù)后較好者。本實驗乳腺癌中EGFR蛋白陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=4.301,P=0.038)，結(jié)果基本一致。

本實驗HSG在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯低于乳腺纖維腺瘤組織和正常乳腺組織，差異具有顯著性(P<0.05)。乳腺癌組織中EGFR的陽性表達率較乳腺纖維腺瘤組織、正常乳腺組織中明顯增高，差異具有顯著性(P<0.05)。HSG和EGFR的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理組織學分級有關(guān)，同時也與ER、 H-erb-2的表達有關(guān)。而HSG和EGFR的蛋白陽性表達率與腫瘤類型、腫瘤大小、臨床分期、年齡因素無關(guān)。Spearman等級相關(guān)分析表明，在乳腺癌組織中HSG的表達與EGFR的表達呈負相關(guān)(γ=-0.531,P<0.05)。

針對EGFR靶點已進行了深入的臨床前研究及廣泛的臨床研究，顯示了靶向治療的廣闊前景。聯(lián)合檢測HSG和EGFR的表達將對判定乳腺癌的生物學行為、預(yù)后和指導治療具有重要意義。同時，由于它們在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，HSG、EGFR及其信號傳遞過程可以作為抗腫瘤治療的新的靶點。隨著作用機制的進一步闡明和臨床資料的累積，以HSG和EGFR為靶點的抗腫瘤治療將得到進一步的重視和廣泛應(yīng)用。

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