王 獻，喻 花

(中南民族大學 化學與材料科學學院，武漢 430074)

在藥物小分子與蛋白質相互作用的研究中，質譜法受到了廣泛地應用.超濾質譜技術是一種新的分析方法，它結合了超濾裝置的分離功能和質譜技術的分析優(yōu)勢，能夠迅速有效地檢測和鑒別出與受體蛋白質相結合的配體小分子.故超濾質譜技術可應用于先導化合物的篩選[1,2]，組合文庫的篩選[3,4]，天然產物有效成分的篩選[5,11].此外，超濾質譜技術具有分析速度快、特異性強、高通量的特點，且樣品用量少、圖譜信息量大，因此在藥物小分子和生物大分子相互作用的研究方面具有巨大的優(yōu)勢.

大黃(RadixetRhizomaRhei)為蓼科植物掌葉大黃RheumPalmatumL.唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf或藥用大黃RheumofficinaleBaill的干燥根和根莖，味苦、性寒.臨床研究證明，大黃具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤、瀉下作用及抗菌、消炎、止血等多種生理活性[12].大黃的主要有效成分為蒽醌類衍生物：大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素及它們與葡萄糖結合成的苷類[13].

本文采用超濾質譜法研究了人血清白蛋白(HSA)與3種蒽醌類化合物(大黃酚、大黃酸和蘆薈大黃素)的相互作用，通過提取離子色譜峰比較了這幾種藥物與HSA的相對結合能力，在此基礎上建立并優(yōu)化了一套超濾質譜法，可應用于研究和篩選與生物靶分子結合的藥物.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國安捷倫科技有限公司)，四極桿飛行時間質譜儀(Agilent 6520 Q-TOF MS，美國安捷倫科技有限公司)，高速冷凍離心機(GL-20M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，超濾膜YM-10(美國Millipore 公司，理論截取分子量10 kDa)，超純水機(Molelement 1815a摩爾元素型，上海摩勒科學儀器有限公司).

人血清白蛋白(HSA，美國Sigma)，大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素純度均≥98％(上海拉丁試劑)，甲醇、乙腈均為色譜純(德國Merck公司)，其他試劑均為優(yōu)級純.

1.2 樣品制備

將HSA溶解于超純水中，配制成100 μM的蛋白質母液，離心，于4℃下冷藏保存.分別準確取一定質量的大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素3種化合物，用甲醇溶解，配置成100 μM的蒽醌類化合物混合溶液母液，離心，于4℃下冷藏保存.超濾實驗前，用超純水5倍稀釋蛋白和藥品溶液母液得到20 μM工作液.

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

C18色譜柱(150mm×4.6mm×5 μm)，柱溫40℃，流速0.2 mL/min.液相色譜梯度洗脫條件：流動相A為超純水，B為乙腈；t=0 min，99％ A(1％ B)；t=0～6 min，30％ A(70％ B)；t= 6～15 min，1％ A(99％ B)；t=15～25 min，1％ A(99％ B)；t=25～30 min，99％ A(1％ B)，進樣量為5 μL.

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，負離子模式檢測，離子掃描范圍50～600m/z，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速12 L/min，霧化器壓力40 psig，毛細管電壓4000V，碎裂電壓125V.

1.4 超濾實驗

吸取20 μL三種化合物的混合工作液，20 μL (20 μM)HSA和160 μL 超純水混合均勻，室溫反應2 h，置于YM-10超濾管中，10000 r/min離心15 min，用200 μL超純水離心清洗濾膜，重復3次，將未結合的配體小分子充分清洗干凈.再向濾膜中加入水/甲醇(50︰50,v/v)，靜置30 min，10000 r/min離心15 min，將藥物小分子從HSA上解離下來，用200 μL水/甲醇(50︰50,v/v)離心清洗濾膜，重復3次，收集洗脫液于進樣瓶中，用LC-MS檢測.實驗以不加入蛋白質的空白實驗為對照組，結合組和對照組均平行實驗3次以上.

2 結果與討論

2.1 標準品混合溶液色譜質譜聯用(LC-ESI-MS)測試條件優(yōu)化

首先建立標準品混合物LC-ESI-MS分析測試方法.將大黃酸、蘆薈大黃素和大黃酚3種物質配成最終濃度為2 μM的混合溶液，它們的摩爾濃度比為1︰1︰2，優(yōu)化LC-ESI-MS條件對標準品混合溶液進行分離測試，結果見圖1.

t/min

由圖1可見，通過優(yōu)化測試的色譜、質譜條件，混合樣品溶液在C18柱中得到了有效分離，峰形較為對稱，17 min內可完成對這3種組分的分離.3種大黃蒽醌類化合物分子式、理論同位素分子量M及形成去質子分子離子[(M-H)-]離子質量見表1.

表1 3種大黃蒽醌類物質分子式、精確分子量和形成負離子的質量

EIC圖中3組峰分別所對應的ESI-MS質譜圖見圖2.對比表1可知，圖2(a)中m/z為283.0287,269.0491,253.0534的分別是大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚的[(M-H)-]峰，故根據質譜圖可以確定圖1中3種物質1、2、3分別為大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚.

m/z

2.2 大黃蒽醌類化合物和人血清白蛋白的競爭性結合實驗

超濾實驗完成后，收集解離下來的大黃蒽醌類化合物混合溶液進LC-MS檢測，檢測條件參照標準品測試條件.對所得的總離子流圖(TIC)進行3種大黃蒽醌類化合物的精確分子量的提取離子分析，結果見圖3.如圖3所示，結合組的3個提取離子流圖 (EIC)色譜峰(即加入蛋白組，實線所示)均在不同程度上高于對照組(即未加蛋白質組，虛線所示)對應的EIC色譜峰.相同的色譜、質譜條件下，EIC色譜峰的積分面積與溶液中該物質的濃度成正比，通過實驗組和空白組的EIC色譜峰鋒面積差異可知3種大黃蒽醌類化合物和HSA均有不同程度的結合，其中大黃酸的結合能力較強，其次是蘆薈大黃素，大黃酚的結合能力最弱.

圖3中3組峰分別對應的ESI-MS質譜圖(圖略)與標準溶液圖2一致，分別對應保留時間為8.942,12.636,16.565 min的質譜圖.由Q-TOF MS給出的精確分子量信息可知，m/z為283.0287的是大黃酸的[(M-H)-]峰，m/z為269.0491的是蘆薈大黃素的[(M-H)-]峰，m/z為253.0534的是大黃酚的[(M-H)-]峰.根據質譜圖可以確定圖3中3種物質按照洗脫時間順序依次為大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚，與上述標準品的色譜峰保留時間一致.

t/min

3 結語

本文通過構建超濾質譜法研究大黃蒽醌類化合物和人血清白蛋白的相互作用，實驗結果表明大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚3種藥物均可與HSA結合，相對結合強度為大黃酸﹥蘆薈大黃素﹥大黃酚，驗證了超濾質譜法是一種研究配體和蛋白質的相互作用快速靈敏有效的分析方法.超濾實驗中同時考慮配體和蛋白質的濃度、孵育時間、解離溶劑的選擇、超濾膜的選擇等，獲得了準確可靠的實驗數據.該超濾質譜方法可廣泛應用于對與各類生物靶分子相互作用的天然產物和藥物的篩選工作.

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