李友軍，羅孝勇，郭向榮

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細胞實驗室，中國長沙 410081)

為闡明Rac 蛋白的激活，表現(xiàn)強烈的時空調(diào)控，即在細胞前沿(leading edge)處于激活狀態(tài)(GTPbound)，而在細胞尾部或兩側(cè)，大多處于失活狀態(tài)(GDP-bound)，作者提出了在細胞前沿，當整合素α4 的胞內(nèi)區(qū)域磷酸化，抑制其與paxillin 結(jié)合時，可形成paxillin-GIT1-PIX-PAK 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而保證Rac 僅在細胞前沿局部化激活的構(gòu)想［1-4］.以免疫印跡、熒光雙定位試驗，確認細胞前沿該信號分子復(fù)合物的存在;以Rac蛋白激活試驗驗證了在纖粘蛋白fibronectin 刺激下，整合素α4 誘導(dǎo)的該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可導(dǎo)致Rac 的激活.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及材料

大腸桿菌E.coli DH5α，CHO 細胞系本實驗室保種;載體EGFP-N1 為本實驗室提供;EcoRⅠ和SaIⅠ限制性內(nèi)切酶，TaqDNA 聚合酶等，均購于Fermentas;單抗購于BD Biosciences，轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP 購于Roche，DMEM 培養(yǎng)基購于Invitrogen，細胞培養(yǎng)皿購于Corning，PVDF 膜為Millipore 產(chǎn)品.

1.2 分子克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)EcoRⅠ和SaIⅠ酶切位點設(shè)計引物:GIT1 5'(CGGAATTCTGATGTCCCGAAAGGGG)GIT1 3'端引物(GCGTCGACTGTCACTGCTTCTTCTC)，以GIT1-ECFP(Addgene)為模板進行PCR 擴增，反應(yīng)條件為:94 ℃變性6 min;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃90 s，反應(yīng)30 個循環(huán);72 ℃延伸8 min.所得PCR 產(chǎn)物為2 386 bp.經(jīng)純化后，用CLONEJET 技術(shù)將PCR 產(chǎn)物克隆入pJET1.2/平端載體，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后經(jīng)EcoRⅠ和SaIⅠ雙酶切檢測，得到陽性克隆.限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SaIⅠ將目的DNA 片斷從pJET1.2/平端載體和GIT1 連接好的質(zhì)粒中切下，連接EGFP-N1 載體(經(jīng)EcoRⅠ和SaIⅠ酶切并純化)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SaIⅠ雙酶切檢測，得到陽性克隆，由上海生工公司測序證實.

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將pEGFP-paxillin，pEGFP-GIT1 分別轉(zhuǎn)染CHO 細胞，根據(jù)選用的Roche 轉(zhuǎn)染試劑的要求比例以及預(yù)實驗結(jié)果，m(選用質(zhì)粒)∶V(轉(zhuǎn)染試劑)為1 μg∶1 μL 的比例，計算每張蓋玻片上的面積，復(fù)合物各組分所需要的量分別為:質(zhì)粒DNA:0.5 μg;轉(zhuǎn)染試劑:0.5 μL;轉(zhuǎn)染混合物總體積(無血清的培養(yǎng)液溶解):100 μL.依次加入無血清培養(yǎng)液、DNA、轉(zhuǎn)染試劑，三者充分混勻.室溫條件下孵育30 min.孵育完成后，去除蓋玻片上原有的培養(yǎng)液(但避免蓋玻片干燥)，蓋玻片置于2 mL 培養(yǎng)皿中，再將轉(zhuǎn)染混合物加到蓋玻片，做好標記，37 ℃恒溫、5%CO2(體積分數(shù))、濕度適宜條件下培養(yǎng)4 h 后吸掉原溶液，加入新鮮的含血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～36 h.

1.4 免疫熒光檢測相關(guān)蛋白的相互作用

轉(zhuǎn)染良好，則應(yīng)立即除去培養(yǎng)液，用PBS 洗1～2 次;加入含40 g/L 多聚甲醛的PBS 緩沖液，暗室中固定5 min;用PBS 緩沖液洗滌兩次，再向每張蓋玻片上分別加入500 μL 含10 g/L 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的PBS 緩沖液封閉，在室溫條件下封閉孵育1 h 左右;用PBS 漂洗兩次，轉(zhuǎn)染了paxillin-EGFP，GIT1-EGFP 兩組細胞中分別加入10 mg/L 用含10 g/L BSA 稀釋的Anti-GIT1 和10 g/L BSA 稀釋的Anti-PIX，4 ℃孵育過夜后，用PBS 洗滌3 次;每張蓋玻片上分別加入100 μL 用超純水按體積比1∶100 稀釋的羊抗鼠標記羅丹明，室溫、避光孵育2～3 h，PBS 漂洗3 次;尼康倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-U)下觀察、照像.

1.5 免疫印跡檢測相關(guān)蛋白的相互作用

細胞傳代3 組CHO 細胞，24～36 h 后，誘導(dǎo)結(jié)束除去培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次;培養(yǎng)皿加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩沖液，使細胞充分裂解;低溫條件下，刮下細胞轉(zhuǎn)移至3 組微量離心管，其中兩組加入Anti-Paxillin，另一組加入Anti-GIT1.抗體孵育完成后，再向每個離心管中分別加入20 μL Protein A/G PLUS-Agarose 冰上搖晃3 h;孵育完成后離心，棄上清，用細胞裂解液洗滌4 次;每組離心管中分別加入20 μL 1×的蛋白質(zhì)電泳Loading Buffer 混合物(包含了DTT)，在沸水中煮5～8 min;將樣品保存在4 ℃冰箱;SDS-聚丙烯胺凝膠電泳;電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)膜，用Bio-rad 凝膠分子成像系統(tǒng)(ChemiDocTM XRS)，選擇合適的曝光時間，對PVDF 膜照像.

1.6 Rac 蛋白激活試驗

將人的全長PAK cDNA 基因按正確讀碼框克隆到pEGFP-N2 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞篩選陽性結(jié)果.將pEGFP-PAK 質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染到CHO 細胞，36 h 后裂解細胞.以抗EGFP 單抗與Protein A/G PLUSAgarose 免疫沉淀.將培養(yǎng)在fibronectinb(5 mg/L)包被的35 mm 培養(yǎng)皿CHO 細胞裂解后，與PAK 瓊脂糖珠共孵育，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后，以抗Rac 單抗在分子成像系統(tǒng)上直接檢測Rac 蛋白激活.

2 結(jié)果與分析

2.1 GIT1-EGFP 質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果分析

本文所用的GIT1 基因和Paxillin 均由美國Addgene 購得.以GIT1-ECFP 質(zhì)粒為模板，引物中加入SalⅠ、EcoRⅠ的酶切位點，對GIT1 基因進行了擴增.DNA 電泳后如圖1.

PCR 擴增后全長GIT1 基因為2 388 bp，經(jīng)拍照檢測，目的片段大小正確.由于目的基因片段大小已經(jīng)達到2 000 bp 以上，酶切位點處于近末端的位置，作者使用直接酶切的辦法可能無法正常地切動，經(jīng)數(shù)次嘗試均無法連接成功，故采用中間載體pJET1.2/平端載體將目的基因環(huán)化，使酶切位點不再處于近末端.該載體具有良好的親和性，并不會產(chǎn)生不必要的其他DNA 片段.將GIT1 基因與pJET1.2/平端載體連接并轉(zhuǎn)化至平皿，長出菌落后，菌落PCR 篩選出陽性克隆.搖菌，提取質(zhì)粒;將GIT1 基因與pJET1.2/平端載體連接的質(zhì)粒和EGFP-N1 質(zhì)粒用SalⅠ和EcoRⅠ進行酶切，酶切產(chǎn)物連接，連接子轉(zhuǎn)化涂板，長出菌落后，菌落PCR 篩選出陽性克隆.搖菌，提取質(zhì)粒;再對質(zhì)粒進行酶切，電泳拍照如圖2.

圖1 PCR 擴增后全長GIT1 基因Fig.1 Full-length human cDNA of GIT1 after PCR amplification

圖2 克隆載體酶切鑒定(EcoRⅠ+SalⅠ)Fig.2 Identification of the enzyme digestion of the expression vector(EcoRⅠ+SalⅠ)

目的基因和載體大小均完全正確，將已經(jīng)構(gòu)建好的pEGFP-GIT1 質(zhì)粒送上海生工公司測序，測序結(jié)果完全正確.

2.2 免疫印跡和免疫沉淀檢測相關(guān)蛋白之間的相互作用結(jié)果

正常CHO 細胞均含有GIT1、Paxillin、PIX 基因及表達蛋白，培養(yǎng)3 組細胞后，作者直接以抗GIT1 的單克隆抗體與細胞裂解液免疫共沉淀，用抗GIT1 或抗paxillin 和抗PIX 的單抗在分子成像系統(tǒng)上直接檢測的western blotting 試驗表明(圖3)，GIT1 與Paxillin、PIX，在活細胞中均存在強烈的相互作用，由此作者證實了在CHO 細胞中GIT1、Paxillin、PIX 三者可以三元復(fù)合體形式存在于細胞中.

圖3 GIT1、paxillin、PIX 蛋白相互作用的western blotting 檢測Fig.3 Western blotting of the interaction between GIT1 and paxillin or PIX

2.3 免疫熒光檢測蛋白之間相互作用的可以發(fā)生在細胞前沿

通過免疫印跡實驗作者證實了，GIT1 與Paxillin、PIX 在活細胞中均存在強烈的相互作用，但它們能否以三元復(fù)合體形式存在于細胞前沿呢?作者利用人纖粘蛋白(Human fibronectin，hFN)誘導(dǎo)CHO 細胞快速貼壁生長，細胞長勢良好，將質(zhì)粒pEGFP-GIT1 轉(zhuǎn)染CHO 細胞，24～36 h 后，熒光顯微鏡下拍照，可以看到轉(zhuǎn)染后偶聯(lián)了綠色熒光蛋白EGFP 的GIT1 蛋白，再分別選用Paxillin 和PIX 的一抗通過免疫熒光檢測(圖4).A1轉(zhuǎn)染的為pEGFP-GIT1 質(zhì)粒，A2 為Anti-Paxillin 孵育后的免疫熒光圖片，A3 為A1、A2 的疊加圖片.B1 轉(zhuǎn)染的為GIT1-EGFP 質(zhì)粒，B2 為Anti-PIX 孵育后的免疫熒光圖片，B3 為B1、B2 的疊加圖片.從圖A3 可以明顯看出Paxillin 與GIT1 具有強烈的相互作用，且這種相互作用可以發(fā)生于細胞前沿或細胞尾部.同理，通過圖B3 可看出GIT1 與PIX 的相互作用也可以出現(xiàn)在細胞前沿、細胞尾部或細胞兩側(cè).

圖4 熒光雙定位試驗Fig.4 Fluorescent co-localization assay

這表明在細胞前沿，確實存在Paxillin 與GIT1，GIT1 與PIX 的相互作用，由此Paxillin-GIT1-PIX 能以三元復(fù)合體形式存在于細胞前沿.

2.4 Rac 蛋白的激活實驗

在纖粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 聚集成簇，α4 胞內(nèi)區(qū)域磷酸化而抑制其與Paxillin 結(jié)合時，Paxillin、GIT1 與PIX、PAK 形成信號分子復(fù)合物.免疫印跡和免疫熒光已證實了Paxillin-GIT1-PIX 能以三元復(fù)合體形式存在于細胞前沿，為確認在纖粘蛋白的刺激下，激活的整合素α4 能否誘導(dǎo)Rac 蛋白處于激活狀態(tài)(GTP-bound)，作者將細胞裂解液與PAK 瓊脂糖珠共孵育.如果Rac 蛋白處于激活狀態(tài)，就能與PAK 蛋白結(jié)合.聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以抗Rac 單抗在分子成像系統(tǒng)上直接檢測.結(jié)果表明(圖5)，上樣的兩種蛋白量基本相同，在纖粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 誘導(dǎo)部分Rac 蛋白處于激活狀態(tài)(GTPbound)，而在無纖粘蛋白刺激的細胞裂解液中，沒有檢測到激活的Rac 蛋白.

圖5 Rac 蛋白激活試驗Fig.5 Rac activation assay

3 討論

Nishiya 等［5］的研究開啟了整合素通過調(diào)控Rac 激活而調(diào)控細胞極性形成的研究領(lǐng)域.細胞骨架蛋白paxillin 通過其不同結(jié)構(gòu)域，與整合素和其他粘附分子結(jié)合，是粘附斑轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因素［6］.由于其他整合素，如αIIbβ3、α5β1 等的α 胞內(nèi)區(qū)域通常不與paxillin 結(jié)合，在細胞尾部、兩側(cè)，由整合素α4 的胞內(nèi)尾部與骨架蛋白paxillin 聯(lián)結(jié)，paxillin 通過其LD4 結(jié)構(gòu)域與GIT1 結(jié)合，形成α4 的胞內(nèi)區(qū)域-paxillin-GIT1 的信號分子復(fù)合物［7-8］.GIT1(G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1)為一涉及多個細胞過程且具多蛋白結(jié)合域的基因，常定位于胞質(zhì)復(fù)合物、粘附斑和細胞前沿［9-10］，可與Arf、Rac 或Cdc42 的下游效應(yīng)分子PAK(P21-activatedkinase)、Rac 的轉(zhuǎn)換因子PIX(PAK-interacting exchange factor)相互作用［11-13］.盡管已經(jīng)證實，paxillin、GIT1 與PIX 之間存在相互作用，但作者的熒光雙定位和免疫印跡實驗是要驗證在CHO 活細胞中，GIT1 與paxillin 或PIX 不僅存在相互作用，且這種相互作用可以發(fā)生在細胞前沿.免疫印跡實驗表明，GIT1與Paxillin、PIX 存在強烈的相互作用，熒光雙定位表明這種相互作用主要發(fā)生在細胞尾部或細胞前沿.這證實了在細胞前沿可以存在paxillin-GIT1-PIX 至Rac 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.Rac 蛋白的激活實驗表明，在纖粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 誘導(dǎo)的該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可使Rac 蛋白處于激活狀態(tài)(GTP-bound).下一步，作者將采用本實驗室開發(fā)的FRET 單分子探針，在confocal 下實現(xiàn)高時空分辨率的可視、實時、定量地追蹤胞內(nèi)局部、瞬時的FRET 信號，以揭示活細胞中誘導(dǎo)激活的Rac 從失活到激活狀態(tài)的時空變化圖像［4］.

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