王洪斌, 花文鳳, 李信書, 李士虎, 閻斌倫

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005)

藻類作為海洋和內(nèi)陸水體中重要的初級(jí)生產(chǎn)者, 在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中有著舉足輕重的地位。微藻具有很重要的生態(tài)價(jià)值[1-2], 微藻在海洋生物中約占40.86%, 其比重非常之大。微藻中固定碳的量約占全球有機(jī)物中的50%[3]。同時(shí)很多天然的產(chǎn)品都來源于微藻[4]。近年來, 化工廢水污染越來越嚴(yán)重, 已經(jīng)威脅到人類的生存環(huán)境, 化學(xué)物質(zhì)通過各種途徑污染水體, 第一個(gè)受害者就是藻類生物。從環(huán)境學(xué)角度來看, 研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)藻類的毒理效應(yīng)至關(guān)重要。自從20世紀(jì)60年代以來, 國(guó)外許多學(xué)者在這方面進(jìn)行了大量的工作, 積累了豐富的資料, 并取得了較為滿意的結(jié)果。在水環(huán)境中, 藻類一旦富集化學(xué)物質(zhì), 便進(jìn)入食物鏈, 經(jīng)過生物逐級(jí)放大, 將危及水生動(dòng)物和人類的健康。

本文以塔瑪亞歷山大藻、海鏈藻和綠色巴夫藻作為供試藻種, 通過2種不同濃度的化學(xué)試劑對(duì)3種海洋微藻的生長(zhǎng)及葉綠素a合成的影響, 研究其對(duì)微藻的毒理效應(yīng), 旨在提示化學(xué)物質(zhì)污染對(duì)水體危害的嚴(yán)重性, 揭示海洋微藻凈化廢水的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、海鏈藻(Thalassiosira weissflogii)、綠色巴夫藻(Pavlova viridis)均為淮海工學(xué)院海洋學(xué)院海藻實(shí)驗(yàn)室保存種。海水培養(yǎng)液采用f/2 加富海水, 微藻培養(yǎng)所用海水采自連云港高公島海域(鹽度約31.00～32.00)漲潮時(shí), 醋酸纖維薄膜過濾, 在121℃下20 min滅菌待用。

硝基苯溶液: 取0.025mL硝基苯于100mL燒杯中, 加適量蒸餾水溶解, 轉(zhuǎn)至100mL容量瓶, 定容至100mL, 然后移至250mL錐形瓶備用。

間苯二酚溶液: 稱取0.03g間苯二酚于100mL燒杯中, 加適量蒸餾水溶解, 轉(zhuǎn)至100mL容量瓶, 定容至100mL, 然后移至250mL錐形瓶備用。

1.2 方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)方法

藻種在 f/2 培養(yǎng)液中培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期接種物。微藻不通氣靜止培養(yǎng), 采用f/2海水培養(yǎng)液, 在無菌條件下將20 mL處于對(duì)數(shù)期的藻種接種于裝有180 mL f/2培養(yǎng)液的500 mL的錐形瓶中, 光照度為3000 lx, 明暗周期12 h /12 h, 每日定時(shí)搖動(dòng)3次, (23 ±1)℃下培養(yǎng)[5]。

1.2.2 微藻生長(zhǎng)測(cè)定

取培養(yǎng)至第4d的藻液200 mL, 分別加入0mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL已配好的硝基苯溶液, 使硝基苯質(zhì)量濃度分別為0、1.5、3、6、12mg/L 5個(gè)梯度, 間苯二酚實(shí)驗(yàn)同硝基苯, 采用吸光度法定時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組。

吸光度的測(cè)定: 以接種時(shí)刻為初始時(shí)間開始測(cè)定, 每天取出5 mL 藻液。以蒸餾水為空白對(duì)照, 分別在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每種藻A值。連續(xù)7d。

比生長(zhǎng)速率計(jì)算:K= (lnNt－lnN0)/T。其中K為比生長(zhǎng)速率,N0為藻液起始濃度,Nt為培養(yǎng)t時(shí)間后的藻液濃度,T為培養(yǎng)時(shí)間(h)。

1.2.3 微藻葉綠素a含量測(cè)定

采用熱乙醇萃取分光光度法[6]取10mL培養(yǎng)至20d的共培養(yǎng)藻液, 5℃、6000r/min離心5min, 棄上清液, 取沉淀-20℃下冷凍12h。取出后迅速用9mL 95%乙醇(80℃預(yù)熱)于80℃熱水浴萃取2min, 超聲波清洗儀超聲振蕩處理10min, 于4℃黑暗靜置6h后, 5℃、6000r/min離心5min, 取上清, 用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)665nm和750nm分別測(cè)定A值, 加入1mol/L鹽酸酸化, 于波長(zhǎng)665nm和750nm處再分別測(cè)定A值, 按下列公式計(jì)算葉綠素含量。

式中, Chla乙醉為乙醇法測(cè)定的葉綠素a質(zhì)量濃度(μg/L);E665為乙醇萃取液于波長(zhǎng)665nm的吸光值;E750為乙醇萃取液于波長(zhǎng)750nm的吸光值;A665為乙醇萃取液酸化后于波長(zhǎng)665nm的吸光值;A750為乙醇萃取液酸化后于波長(zhǎng)750nm的吸光值;V乙醇為乙醇萃取液的體積(mL);V藻樣為藻樣的體積(L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝基苯對(duì)3種海洋微藻生長(zhǎng)量的影響

2.1.1 塔瑪亞歷山大藻( A. tamarense )

低質(zhì)量濃度的硝基苯對(duì)A. tamarense抑制作用不明顯, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),A. tamarense的生長(zhǎng)量雖然都在增長(zhǎng), 但硝基苯質(zhì)量濃度越高,A. tamarense的比生長(zhǎng)速率越小。對(duì)照組生長(zhǎng)最好, 在硝基苯質(zhì)量濃度為12mg/L時(shí)抑制現(xiàn)象最為明顯, 與對(duì)照組比較, 抑制率達(dá)22.3%, 這與杜慶才等[7]和沈洛夫等[8]的研究結(jié)論一致。結(jié)果見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度硝基苯對(duì)A. tamarense生長(zhǎng)量的影響 Fig. 1 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of A. tamarense

2.1.2 海鏈藻(T. weissflogii)

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加, 不同質(zhì)量濃度的硝基苯條件下,T. weissflogii的生長(zhǎng)量有一個(gè)先降后升的趨勢(shì), 這可能是微藻對(duì)硝基苯有一個(gè)短暫的適應(yīng)期。整體來看, 硝基苯對(duì)T. weissflogii的抑制現(xiàn)象不及另外2種藻明顯, 從其生長(zhǎng)曲線圖(圖2)可以看出, 它反而有一定的促進(jìn)作用, 這與杜慶才等[7]的研究結(jié)論不一致, 可能由于海洋微藻得的種屬差異對(duì)硝基苯 的毒性作用產(chǎn)生差異, 尚有待進(jìn)一步研究。硝基苯質(zhì)量濃度的增大對(duì)T. weissflogii的比生長(zhǎng)速率影響不明顯, 由圖2可以看出, 對(duì)照組及1.5mg/L組在第7天時(shí)生長(zhǎng)量最低, 其他3組均高于對(duì)照組水平。

圖2 不同質(zhì)量濃度硝基苯對(duì)T. weissflogii生長(zhǎng)量的影響 Fig. 2 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of T. weissflogii

2.1.3 綠色巴夫藻(P. viridis)

由圖3可知, 對(duì)照組生長(zhǎng)最好, 硝基苯的添加對(duì)P. viridis的生長(zhǎng)有抑制作用,隨著硝基苯質(zhì)量濃度的增大, 對(duì)P. viridis的生長(zhǎng)量抑制越明顯。硝基苯質(zhì)量濃度為12mg/L時(shí), 抑制率相對(duì)于對(duì)照組達(dá)到了20.04%, 在其他質(zhì)量濃度下, 相對(duì)于對(duì)照組的抑制率都在9%左右。所以, 對(duì)于P. viridis, 硝基苯抑制作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

圖3 不同質(zhì)量濃度硝基苯對(duì)P. viridis生長(zhǎng)量的影響 Fig. 3 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of P. viridis

2.2 間苯二酚對(duì)3種海洋微藻生長(zhǎng)量的影響

2.2.1 塔瑪亞歷山大藻( A. tamarense )

加間苯二酚后,A. tamarense的生長(zhǎng)并沒有和預(yù)計(jì)的一樣受到明顯抑制, 反而是添加一定量的間苯二酚, 其生長(zhǎng)更好, 不同質(zhì)量濃度的間苯二酚對(duì)其均有一定的促進(jìn)作用, 且在間苯二酚質(zhì)量濃度為3mg/L時(shí),A. tamarense的生長(zhǎng)量高于對(duì)照組13.26%。此結(jié)論與許文武等[9]有差異, 是否說明A. tamarense在生長(zhǎng)代謝過程中能利用間苯二酚有待證實(shí), 但揭示了海洋微藻在處理化工廢水方面有潛在的應(yīng)用前景。由圖4可知, 在質(zhì)量濃度為3mg/L時(shí), 第7天生長(zhǎng)量達(dá)到了最高, 高于對(duì)照組13.26%, 間苯二酚質(zhì)量濃度高于3mg/L時(shí), 它的促進(jìn)率又有所下降。

2.2.2 海鏈藻(T. weissflogii)

由圖5可知, 除個(gè)別數(shù)據(jù)外, 隨著間苯二酚質(zhì)量濃度的增加,T. weissflogii的生長(zhǎng)量整體受到抑制, 質(zhì)量濃度越大, 抑制現(xiàn)象越明顯。間苯二酚的質(zhì)量濃度為12mg/L時(shí), 第7天時(shí)生長(zhǎng)量相對(duì)于對(duì)照組的抑制率最大, 生長(zhǎng)量只有對(duì)照組的73.9%。

圖4 不同質(zhì)量濃度間苯二酚對(duì)A. tamarense生長(zhǎng)量的影響 Fig. 4 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of A. tamarense

圖5 不同質(zhì)量濃度間苯二酚對(duì)T. weissflogii生長(zhǎng)量的影響 Fig. 5 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of T. weissflogii

2.2.3 綠色巴夫藻(P. viridis)

由圖6可知, 對(duì)照組如預(yù)期的一樣生長(zhǎng)的最好, 隨著間苯二酚質(zhì)量濃度的增加,P. viridis的生長(zhǎng)量相對(duì)于對(duì)照組的抑制率逐漸增大, 當(dāng)間苯二酚的質(zhì)量濃度為6mg/L時(shí), 生長(zhǎng)量是對(duì)照組的76.4%, 相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)組抑制率最大。

2.3 硝基苯對(duì)3種海洋微藻葉綠素a的影響

加硝基苯的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組,A. tamarense葉綠素 a的含量均有下降趨勢(shì), 波動(dòng)較大, 在3mg/L實(shí)驗(yàn)組, 葉綠素a含量最低, 僅為對(duì)照組的68.6%, 1.5mg/L實(shí)驗(yàn)組葉綠素a的含量相對(duì)最高, 為對(duì)照組的89.7%; 硝基苯對(duì)T. weissflogii葉綠素a的抑制現(xiàn)象不明顯, 而在6mg/L實(shí)驗(yàn)組, 還促進(jìn)了T. weissflogii葉綠素a含量增長(zhǎng), 高出對(duì)照組的0.7%, 在硝基苯質(zhì)量濃度為12mg/L時(shí), 葉綠素a含量受到抑制, 為對(duì)照組的89.17%, 與上述的生長(zhǎng)量實(shí)驗(yàn)結(jié)論是一致的;P. viridis所有實(shí)驗(yàn)組中, 葉綠素a含量均小于對(duì)照組, 也就是說硝基苯對(duì)P. viridis葉綠素a 起到了抑制作用, 在12mg/L時(shí), 抑制率最大, 葉綠素a的含量達(dá)到最低, 僅為對(duì)照組的41%。硝基苯對(duì)3種海洋微藻葉綠素a含量的影響(圖7)主要表現(xiàn)在降低葉綠素a 的合成量, 其中對(duì)A. tamarense和P. viridis葉綠素a含量的影響呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng), 而對(duì)于T. weissflogii, 硝基苯對(duì)其葉綠素a的影響波動(dòng)不大, 結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不一致, 有待深入研究。

圖6 不同質(zhì)量濃度間苯二酚對(duì)巴夫藻生長(zhǎng)量的影響 Fig. 6 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of P. viridis

圖7 不同質(zhì)量濃度硝基苯對(duì)3種微藻葉綠素a含量的影響 Fig. 7 Effect of different concentration of nitrobenzene on the content of Chlorophyll a of 3 marine microalgae

2.4 間苯二酚對(duì)三種海洋微藻葉綠素a的影響

由圖 8可知, 加間苯二酚后, 各實(shí)驗(yàn)組A. tamarense的葉綠素a含量均小于對(duì)照組, 但影響不明顯, 6mg/L組與12mg/L組的葉綠素a的含量分別為對(duì)照組的90.14%、92%, 與上述生長(zhǎng)量結(jié)論一致。間苯二酚對(duì)T. weissflogii葉綠素a含量的影響隨質(zhì)量濃度的增大而增大, 與對(duì)照組相比,T. weissflogii各實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量均有所下降, 6mg/L組與12mg/L組的葉綠素a的含量分別為對(duì)照組的58%、52%。相比較A. tamarense和T. weissflogii, 間苯二酚對(duì)P. viridis葉綠素a的影響更明顯, 隨著間苯二酚質(zhì)量濃度的增加, 葉綠素a的含量在逐漸下降, 且在質(zhì)量濃度為12mg/L時(shí), 葉綠素a含量最低, 僅為對(duì)照組的1.1%。

3 結(jié)論

不同質(zhì)量濃度的2種化學(xué)物質(zhì)對(duì)供試的3種海洋微藻的生長(zhǎng)均有一定程度的影響。其中硝基苯對(duì)A. tamarense和P. viridis的生長(zhǎng)抑制作用隨硝基苯質(zhì)量濃度的增加抑制越明顯。硝基苯對(duì)T. Weissflogii生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。間苯二酚對(duì)T. weissflogii和P. viridis的生長(zhǎng)抑制作用隨間苯二酚質(zhì)量濃度的增加抑制越明顯。而對(duì)于A. tamarense, 不同質(zhì)量濃度的間苯二酚對(duì)其生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用。

圖8 不同質(zhì)量濃度間苯二酚對(duì)3種微藻葉綠素a含量的影響 Fig. 8 Effect of different concentration of resorcinol on the content of Chlorophyll a of 3 marine microalgae

硝基苯對(duì)A. Tamarense和P. Viridis葉綠素a含量的影響呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng), 對(duì)T. Weissflogii葉綠素a的影響不大; 間苯二酚對(duì)3種海洋微藻葉綠素a 含量影響程度有所差異, 其中對(duì)A. tamarense影響極不明顯。

T. Weissflogii和A. tamarense在含硝基苯和間苯二酚組分的化工廢水處理方面具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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