孫穎穎, 王 輝

(1. 淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005; 2. 北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所, 北京 101111)

海洋微藻在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)不斷向外分泌黏性物質(zhì), 稱為胞外產(chǎn)物(Extracellular products, ECP)[1]。胞外多糖(Extracellular polysaccharides, ECPS)是胞外產(chǎn)物的主要組成成分, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)的微食物鏈及微生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[2]。研究表明, 微藻胞外多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和免疫調(diào)節(jié)等生理活性[3-6]。例如, 黃鍵等[3]指出, 紫球藻(Porphyridium cruentum)胞外多糖在體外具有抗乙肝病毒作用。王大志等[4]指出, 爪哇曲殼藻亞縊變種(Achnanthes javanicavarsubconstricta)、咖啡形雙眉藻 (Amphora coffeaeformis)和多枝舟形藻(Navicula ramosissima)胞外多糖具有抗病毒VHSV 和ASFV活性。Sogawa等[5]發(fā)現(xiàn)一種浮游硅藻具有抗腫瘤K-562細(xì)胞活性。Umemura等[6]發(fā)現(xiàn)裸甲藻(Gymnodiniumsp.)多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。目前, 某些微藻胞外多糖的抗氧化活性也被報(bào)道[7-10]。石全見(jiàn)等[7]指出紫球藻胞外多糖具有清除超氧陰離子(O2·ˉ)和羥基自由基(·OH)的能力, 對(duì)它們的半抑制率IC50分別為0.114 g/L和0.619 g/L。朱勁華等[8]指出硒化紫球藻胞外多糖在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的較低濃度范圍內(nèi)具有抗氧化活性。薔薇藻(Rhodella reticulata)[9]和裂壺藻(Schizochytriumsp.)[10]等2種海洋微藻的胞外多糖能有效清除·OH、O2·ˉ和過(guò)氧化氫(H2O2)等活性氧。

前期研究發(fā)現(xiàn), 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)有較高含量的胞外多糖(ECPS), 可達(dá)藻細(xì)胞干質(zhì)量的30%[11]。采用離子交換柱層析和凝膠柱層析等分離技術(shù)進(jìn)行了純化, 制備到一種胞外純多糖, 記為ECPSⅢ。在此基礎(chǔ)上, 本文通過(guò)測(cè)定胞外純多糖ECPSⅢ對(duì)O2·ˉ、·OH和H2O2等活性氧的清除以及還原力, 研究了其體外抗氧化活性; 同時(shí), 通過(guò)測(cè)定ECPSⅢ中的硫酸基和糖醛酸的含量, 初步分析了其理化性質(zhì), 以期為球等鞭金藻胞外多糖的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻胞外純多糖ECPSⅢ為白色粉末狀固體, 由江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 球等鞭金藻胞外多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生超氧陰離子[12]。反應(yīng)體系為3.0 mL的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH 8.2), 其中含有3 mmol/L鄰苯三酚, 以及不同濃度的多糖樣品溶液(0.05～1.6 g/L, 分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 g/L, 下同)。在325 nm波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化速率。抑制率(%) = (A-B)/A× 100,A為對(duì)照組吸光度的變化速率,B為樣品組吸光度的變化速率。

1.2.2 球等鞭金藻胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

在Smirnoff等方法[13]的基礎(chǔ)上, 加以改進(jìn), 測(cè)定對(duì)羥基自由基的清除作用。在3 mL 150 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.4)中含有10 mmol/L FeSO4, 2 mmol/L水楊酸鈉, 6 mmol/L H2O2以及不同濃度的多糖樣品溶液(0.05～1.6 g/L, 同上)。37℃下反應(yīng)1 h, 測(cè)定510 nm處的吸光度。抑制率(%)= [1 -(Asample-Asampleblank)/Acontrol] × 100,Acontrol為對(duì)照組的吸光度值,Asample為樣品組的吸光度,Asampleblank為樣品空白的吸光度。

1.2.3 球等鞭金藻胞外多糖對(duì)H2O2的清除作用

采用分光光度法測(cè)定多糖對(duì)H2O2的清除作用[14]。多糖樣品溶解在3.4 mL 的PBS中(pH 7.4), 再加入0.6 mL40 mmol/L H2O2, 搖勻后, 在室溫下反應(yīng)10 min, 在230 nm處測(cè)定吸光度。抑制率(%)= [1 -(Asample-Asampleblank)/Acontrol] × 100,Acontrol為對(duì)照組的吸光度,Asample為樣品組的吸光度,Asampleblank為樣品空白的吸光度。

1.2.4 球等鞭金藻胞外多糖的還原力

[15]方法, 測(cè)定多糖還原力。0.5 mL不同濃度的多糖樣品溶液, 1.25 mL PBS(pH 6.6, 0.2 mol/L)溶液以及10 g/L K3Fe(CN)6溶液1.25 mL, 50℃下反應(yīng)20 min。然后, 加入100 g/L TCA1.25 mL, 6 000 r/min離心10 min。2.5 mL上清液與0.25 mL新配制的1 g/LFeCl3混合, 搖勻后, 在700 nm處檢測(cè)反應(yīng)體系溶液的吸光度, 溶液的吸光度增加說(shuō)明樣品的還原力增強(qiáng)。

1.2.5 球等鞭金藻胞外多糖的硫酸基測(cè)定

采用硫酸比濁法[16]檢測(cè), 由標(biāo)準(zhǔn)硫酸鹽作參比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 球等鞭金藻胞外多糖的糖醛酸測(cè)定

采用硫酸-咔唑法[17]測(cè)定, 以葡萄糖醛酸作參比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,P＜ 0.05為顯著性差異,P＜ 0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對(duì)超氧陰離子的清除作用

由圖1可以看出, 在濃度0.05～1.6 g/L范圍內(nèi), ECPSⅢ對(duì)超氧陰離子的清除率隨多糖濃度升高而顯著(P＜ 0.05)增強(qiáng)。當(dāng)濃度為1.6 g/L時(shí), 抗壞血酸(Vc)和ECPSⅢ對(duì)超氧陰離子的清除率分別為52.7%和48.5%。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度范圍內(nèi), ECPSⅢ對(duì)超氧陰離子的清除作用與Vc接近。

圖1 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對(duì)超氧陰離子的清除作用 Fig. 1 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against superoxide radical with ascorbic acid applied as a positive control

2.2 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對(duì)羥基自由基的清除作用

圖2表明, 隨著多糖濃度的升高, ECPSⅢ對(duì)羥基自由基的清除作用顯著(P＜ 0.05)增強(qiáng)。當(dāng)濃度為1.6 g/L時(shí), ECPSⅢ對(duì)羥基自由基的清除率分別達(dá)到63.6%。Vc濃度為0.8 g/L時(shí), 其對(duì)羥基自由基的清除率為64.2%, 這表明, ECPSⅢ具有中等清除羥基自由基的能力。

2.3 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對(duì)H2O2的清除作用

在圖3中, 當(dāng)多糖濃度從0.05增加至1.6 g/L時(shí), ECPSⅢ對(duì)H2O2的清除率從7.76%升至49.8%, 其對(duì)H2O2的清除作用隨多糖濃度的升高而顯著(P＜ 0.05)增強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度范圍內(nèi), ECPSⅢ對(duì)H2O2的清除作用顯著(P＜ 0.05)低于Vc對(duì)H2O2的清除作用。

圖2 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對(duì)羥基自由基的清除作用 Fig.2 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against hydroxyl radical with ascorbic acid applied as a positive control

圖3 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對(duì)過(guò)氧化氫的清除作用 Fig.3 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against hydrogen peroxide with ascorbic acid applied as a positive control

2.4 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的還原力

隨著多糖濃度的升高, ECPSⅢ的還原力顯著 (P＜ 0.05)增加。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度范圍內(nèi), Vc對(duì)赤血鹽溶液的還原作用顯著(P＜ 0.05)高于ECPSⅢ對(duì)赤血鹽溶液的還原作用(圖4)。

2.5 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的硫酸基和糖醛酸含量

硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線為,y= 5.1419x-0.0306 (R2= 0.9881), 其中,x為硫酸基質(zhì)量(mg),y為A530。

葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為,y= 5.1419x-0.0306 (R2= 0.9818), 其中,x為葡萄糖醛酸質(zhì)量(mg),y為A360。

通過(guò)計(jì)算, 得到ECPSⅢ中硫酸基和糖醛酸含量, 分別為76.90 mg/g和17.1%。

圖4 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的還原力 Fig. 4 Total reductive potential of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana with ascorbic acid applied as a positive control

3 討論

微藻胞外多糖是微藻在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外、易與菌體分離的水溶性多糖或多糖復(fù)合物, 具有多樣性和復(fù)雜性等特點(diǎn), 并且因?yàn)槠淅砘再|(zhì)獨(dú)特, 生物活性優(yōu)良而備受關(guān)注。球等鞭金藻富含多不飽和脂肪酸, 蛋白質(zhì)和多糖[18-20], 是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用的餌料微藻。近年來(lái), 隨著微藻多糖研究的深入, 對(duì)球等鞭金藻多糖的研究日益增多[18-23]。然而, 相對(duì)于其他微藻多糖而言, 球等鞭金藻多糖的研究尚處于起步階段, 尤其是胞外多糖的研究[11,21]。

通過(guò)前期研究, 制備到球等鞭金藻胞外純多糖ECPSⅢ。在此基礎(chǔ)上, 本文通過(guò)測(cè)定ECPSⅢ對(duì)O2·ˉ、·OH和H2O2等活性氧的清除作用和還原力, 初步分析了ECPSⅢ的體外抗氧化活性。結(jié)果表明, ECPSⅢ具有清除O2·ˉ、·OH 和H2O2的能力, 尤其對(duì)O2·ˉ和·OH的清除作用較強(qiáng)。以Vc作為對(duì)照, ECPSⅢ具有中高等強(qiáng)度清除O2·ˉ和·OH的能力(圖1、圖2和圖3)。ECPSⅢ具有一定的還原力, 但顯著低于Vc的還原力(圖4)。王凌等將紫球藻胞外多糖進(jìn)行降解處理, 發(fā)現(xiàn)其降解組分的總還原力與Vc相近, 對(duì)O2·ˉ和·OH的清除率可達(dá)到94.89%和88.98%[24]。石全見(jiàn)采用降解和衍生化兩種修飾方法處理紫球藻胞外多糖, 制備到一種具有較強(qiáng)抗氧化能力的多糖, 對(duì)O2·ˉ和·OH的清除率在70%以上[25]。這些研究表明, 微藻胞外多糖通過(guò)某些處理(降解、硫酸酯化和羧甲基化等)可以提高其抗氧化活性。因此, 通過(guò)某些處理, 很可能進(jìn)一步提高ECPSⅢ的抗氧化能力。

同時(shí), 本文還測(cè)定了ECPSⅢ中的糖醛酸含量, 為17.1%。梅秋紅等[26]指出銅綠微囊藻胞外純多糖EAPAⅠ的糖醛酸含量為10.74%。林壽[27]認(rèn)為糖醛酸的存在是酸性多糖具有特殊生理活性的重要原因之一。梅秋紅等[26]發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻胞內(nèi)多糖的糖醛酸含量高于其胞外多糖的糖醛酸含量, 為12.75%。他們指出胞內(nèi)多糖的酸性較胞外多糖更強(qiáng), 從而可能導(dǎo)致它們的生物學(xué)效應(yīng)有所區(qū)別。硫酸基也是微藻多糖具有生物活性和生理功能的主要官能團(tuán)[28,29]。石全見(jiàn)等[25]發(fā)現(xiàn)不同硫酸基含量的多糖抗氧化能力存在明顯差異, 隨著硫酸基含量增大, 多糖抗氧化能力增強(qiáng)。本研究中, ECPSⅢ中硫酸基含量為76.90 mg/g, 銅綠微囊藻胞外純多糖EAPAⅠ的硫酸基含量為44.44 mg/g[26], 新月菱形藻和紫球藻胞外多糖的硫酸基含量不超過(guò)4%[30-31]。上述結(jié)果表明, ECPSⅢ中硫酸基和糖醛酸含量較高。

球等鞭金藻是一種已經(jīng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖的海洋微藻, 在培養(yǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生含量豐富的胞外多糖[21], 并且胞外多糖中酸性多糖的含量顯著高于中性多糖的含量。同時(shí), 本文結(jié)果表明, 胞外純多糖具有一定的抗氧化活性, 還富含硫酸基和糖醛酸。這就表明, 球等鞭金藻胞外多糖具有廣闊的應(yīng)用前景。

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