楊陽

(黑龍江護理高等?？茖W校 黑龍江哈爾濱 150000)

本文旨在探討分析抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產物的檢測和鑒定,具體報告如下:

1 儀器與試藥

(1)儀器。氣質聯(lián)用儀生產廠家Agilent,型號5973/6890;色譜柱為HP-1氣相色譜柱(毛細),長度17m,內徑200μm,厚度0.11μm,5%苯基交聯(lián)甲基聚氧硅烷;載氣為0.9ml/min流速的氦氣;柱頭壓力為113kPa;進樣口設定溫度為280℃;檢測接口設定溫度為290℃;升溫程序為初始溫度180℃,以3.3℃/min提升至231℃,后以30℃/min提升至310℃,2分鐘保留;進樣方式為分流進樣,以1:8.9為分流比,以10ml/min為分流口流速;進樣體積為2μl;質譜電離方式為EI,電子能力為70ev;采集模式為全范圍掃描m/z 50-650amu[1]。

(2)試藥。他莫昔芬:阿斯利康白色片劑,由英國捷利康公司生產,每片含15.2mg枸櫞酸他莫昔芬(即10mg他莫昔芬)。

(3)陽性尿樣收集。選取20名健康的男性志愿者,在服用藥物之前收集2次尿液,于清晨空腹狀態(tài)下服用藥物,在服用藥物后的72小時內收集各次排尿,和72小時后的4天內的晨尿,對每次排尿的體積和時間進行記錄。志愿者服用他莫昔芬的劑量為1片阿斯利康白色片劑(即10mg他莫昔芬)。

(4)陽性尿樣前提取方法。提取所有志愿者服用藥物之前尿樣和服用藥物36小時后的尿樣各5ml,pH值在6.4-6.7范圍。以固相萃取-酶解-液相萃取-氣質聯(lián)用儀上樣分析的前提取方法處理。具體操作為:將尿樣(5ml)置于試管內,在離心后收集上清液放置在C18柱之上,用水(5ml)對柱床洗滌,再用甲醇(4ml)洗脫,收集洗脫液放置在旋轉蒸發(fā)儀上,以50℃講甲醇蒸出。在蒸干物至放入加pH值6.8的磷酸鹽緩沖液(1ml)及β-葡萄糖醛酸甙酶(50μl),在渦旋混勻后,放置在55℃的水浴箱中進行3小時酶解,在酶解完成后,將試管取出,放入固體緩沖鹽(0.1g),將pH值調至8.8,放入叔丁基甲醚(5ml)進行萃取,再放置在渦旋振蕩器上進行1分鐘混合,以2500rpm進行5分鐘離心,以吸管收集上層的醚液,放置到干燥的試管內,在氮氣(65℃)下將其吹干,使用氣質聯(lián)用儀上樣分析[2]。

(5)他莫昔芬的尿中代謝產物結構鑒定。對代謝產物標準品的合成,經(jīng)EI與CI對比進樣分析、高分辨質譜對分子量測定并擬合分子式、串聯(lián)質譜到離子譜來分析。以氣相色譜與高分辨質譜聯(lián)用,經(jīng)色譜柱分離樣品后,在不同的時間進入到高分辨質譜中,用精確質量(PFK峰)對測量到的質量數(shù)進行校準,使用計算軟件得出元素組成。

2 結果

表1 尿中原型和代謝產物的檢出情況

(1)尿中代謝產物檢測情況。結果顯示尿中代謝產物主要為結合型葡萄糖醛酸,少數(shù)為游離型葡萄糖醛酸(不穩(wěn)定)。尿樣經(jīng)過酶解后提取,在提取的離子色譜圖可見代謝物峰。同時和提取的服用藥物之前尿樣的離子色譜圖對比,發(fā)現(xiàn)17.54分鐘為代謝物峰,即雌激素藥物他莫昔芬尿中主要代謝產物Met.C,分子量是417。在17.30分鐘發(fā)現(xiàn)另外一個較低的代謝物峰,分子離子為473,此代謝產物為Met.U,即抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產物主要為Met.C與Met.U。尿中原型和代謝產物的檢出情況,詳見表1:

(2)他莫昔芬的尿中代謝產物結構鑒定。結果發(fā)現(xiàn)他莫昔芬的尿中代謝產物的元素組成是C30H39O3NSi,在EI與CI的譜圖上可見m/e489(M+)與m/e490(M+1),證實MSTFA的產物分子量為489。

3 討論

抗雌激素藥物,即雌激素受體的抑制劑,是對雌激素受體作用的一類藥物,該藥物能夠和雌二醇爭奪雌激素受體,發(fā)揮阻斷雌激素的作用。臨床主要應用該藥物治療乳腺癌、不孕不育癥等和激素有關的疾病。但近年來,濫用興奮劑者將該藥物用于男性參加的體育競賽當中,使體內的睪酮水平提高,同時對抗服用了外源性的類固醇所產生的副作用。IOC在2003年頒布的禁用物質和禁用方法表中明確規(guī)定男性禁用抗雌激素藥物(他莫昔芬,氯米芬,環(huán)芬尼)[3]。為了建立常規(guī)檢測抗雌激素藥物他莫昔芬陽性尿樣的方法,對抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產物進行結構鑒定,我們選擇他莫昔芬作為研究藥物,對該藥在尿中的代謝產物進行檢測和鑒定分析。本研究通過GC/MS技術檢測和鑒定抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產物。檢測結果證實,志愿者服用藥物后的排出的尿液中只有少量的他莫昔芬代謝產物提示該藥在體內代謝廣泛,但不經(jīng)尿液排出,而是通過膽汁排出。他莫昔芬是三苯氧胺結構藥物,脂溶性相對較高,極易通過腎小管重復吸收,長期停留在體內。另外,該藥在體內的代謝還進行肝腸循環(huán),在以葡萄糖醛酸甙的形式進入膽汁,腸道吸收較慢,經(jīng)β-葡萄糖醛酸水解酶的水解成原型,使脂溶性增大,又經(jīng)腸道吸收進入到門靜脈,使尿液中的代謝產物存留時間延長,單劑量服用該藥物,在20天后仍可檢出。

綜上所述,采用GC/MS技術檢測和鑒定抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產物準確可靠,抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產物主要為Met.C,分子式C27H31NO3,分子量417。

[1]劉先軍,張晶,邵兵,等.固相萃取-液相色譜串聯(lián)質譜法測定城市污水中他莫昔芬和來曲唑[J].分析化學,2012,38(2):214-218.

[2]馬宗會,樊在霞,聶華麗,等.他莫昔芬微膠囊的制備及體外藥物釋放性能研究[J].中國藥學雜志,2008,43(16):1248-1251.

[3]張倩,朱余兵,于翠霞,等.枸櫞酸他莫昔芬分散片在健康人體的藥動學和生物等效性研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2008,13(3):303-307.