陳曉宇，榮延平，張士軍，黃仁彬 （廣西醫(yī)科大學藥理學教研室，廣西 南寧530021）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱早老性癡呆，是以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前尚無特效治療方法［1］。研究表明，AD 的發(fā)病率隨著年齡的增長，呈指數(shù)上升，嚴重威脅著老年人的健康和生存質量，該病的防治已成為國內(nèi)外醫(yī)學界研究的熱點［2］。

玉郎 傘Millettia Pulchra Kurz var.Laxior（Dunn）Z Wei.（YLS）是廣西壯族習用藥材，具有補氣、補血、提高免疫力、抗衰老、抗應激、改善大腦記憶等功能。臨床用于治療老年健忘、小兒智力低下、體弱多病及病后、產(chǎn)后虛弱等癥。其成分復雜，主要活性成分有多糖、黃酮、皂苷類等［3－5］。本研究從YLS提取多糖成分，并研究了玉郎傘多糖（YLSP）對Aβ25－35誘導PC12細胞凋亡的保護作用。

1 材料

1.1 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（371型，Thermo scientific）；低速離心機（TDL－5－A 型，飛鴿）；倒置相差顯微鏡（CKX41 型，OLYMPUS）；透射電鏡（H－7650型，HITACHI）；酶標儀（Multiskan MK3 型，Thermo labsystems）。

1.2 藥品與試劑 YLSP（由廣西醫(yī)科大學藥理學教研室提供，純度93.1%，用HPLC 測定，批號20110302）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號866169，購自Gibco公司）；DMEM 低糖培養(yǎng)基（批號NVJ0306，購自HyClone公司）；Aβ25－35（批號05OM4765，購自Sigma公司）；胎牛血清（FBS，批號A64905－0972，購自HyClone公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號M8180，購自Solarbio Amresco）；石杉堿甲（豫中制藥廠，批號H10940156）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 神經(jīng)元細胞株 PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆株）購于中科院上海細胞所。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清，100 U·mL－1青霉素，100 U·mL－1鏈霉素，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48～72 h傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞存活率檢測及形態(tài)學改變 取培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)生長期的PC12細胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基將細胞稀釋，以2×105個／mL細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃含5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，實驗共分6組，每組4孔?？瞻讓φ战M：每孔只加入200μL無血清DMEM 低糖培養(yǎng)基；模型組：每孔分別加入用無血清DMEM 低糖培養(yǎng)基配制的終濃度為10μmol·L－1的Aβ25－35溶液200μL。陽性對照藥組：用無血清DMEM 低糖培養(yǎng)基配制的石杉堿甲溶液至終濃度為1μmol·L－1，再加入Aβ25－35至終濃度為10μmol·L－1，終體積為200μL。YLSP 處理組：各組分別加入用無血清DMEM 低糖培養(yǎng)基配制的YLSP 溶液至終質量濃度為0.01，0.1，1.0μg·mL－1，再加入Aβ25－35至終濃度為10μmol·L－1，各孔終體積為200μL。將孔板置于37 ℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入終質量濃度0.5 mg·mL－1MTT（20μL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振搖混勻5 min，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，在酶標儀492 nm 處測定吸光度值［5］。根據(jù)公式計算：細胞存活率＝待測組細胞OD／空白對照組細胞OD×100%。

取培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)生長期的PC12 細胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基將細胞稀釋，以2×105個／mL細胞密度接種于孔內(nèi)置有清潔蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，每孔500μL，放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃含5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，實驗共分3組：空白對照組、模型組、1.0μg·mL－1YLSP組，每組4孔。按上法（MTT 法）分組及培養(yǎng)，每孔保證總體積500μL，在倒置相差顯微鏡下（100×）觀察各組PC12細胞的存活及神經(jīng)突觸生長情況。

2.3 透射電鏡觀察 將PC12 細胞以2×105個／mL接種于6孔板，每孔2 mL，當細胞的生長進入對數(shù)生長期時（約24 h），將細胞分3 組：空白對照組、模型組、1.0μg·mL－1YLSP 組，處 理24 h 后，2%戊二醛PBS固定（4 ℃），1 000 r·min－1離心10 min，PBS重懸細胞，吸入有瓊脂空槽的離心管中，1 000 r·min－1離心10 min，切下尖槽內(nèi)含細胞團的瓊脂塊，1%戊 二 醛 固 定（4 ℃），PBS 漂 洗1 次，1%鋨酸后固定2 h，30%、50%、70%乙醇逐級脫水10 min，4%醋酸雙氧鈾快染過夜，80%、95%乙醇脫水10 min，100%乙醇脫水10 min×2次，環(huán)氧丙烷置換10 min×2次，環(huán)氧樹脂梯度滲透，618環(huán)氧樹脂包埋60 ℃、48 h，金剛刀超薄切片機切片，片厚70 nm，醋酸鉛片染2 min，透視電鏡（H－7650，HITACHI）觀察、攝片。

3 結果

3.1 YLSP對Aβ25－35所致PC12細胞損傷的保護作用 由表1 可見，與空白對照組相比較，加入10 μmol·L－1Aβ25－35損傷因素后，細胞存活率顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，YLSP 各濃度組均使細胞存活率顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 YLSP對Aβ25－35所致PC12細胞損傷的保護作用±s，n＝4）Tab 1 Protective effects of YLSP on the Aβ25－35－induced cytotoxicity in PC12 cells±s，n＝4）

表1 YLSP對Aβ25－35所致PC12細胞損傷的保護作用±s，n＝4）Tab 1 Protective effects of YLSP on the Aβ25－35－induced cytotoxicity in PC12 cells±s，n＝4）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，c P＜0.01

組別 濃度 細胞存活率／%00模型－59.51a石杉堿甲 1μmol·L－1 72.97c YLSP低劑量組 0.01μg·mL－1 75.05c YLSP中劑量組 0.1μg·mL－1 71.22c YLSP高劑量組 1.0μg·mL－1 68.56空白對照－100.b

倒置相差顯微鏡觀察結果：空白對照組的PC12細胞，細胞個體飽滿，突觸明顯，交織成網(wǎng)狀，細胞呈現(xiàn)多邊形、菱形或梭形，細胞長勢很好，細胞的折光性正常。模型組PC12細胞可見細胞膜外圍的突觸回縮甚至消失，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，細胞聚集成團，數(shù)量明顯減少，大多數(shù)細胞由多邊形變成不規(guī)則形狀和圓形，細胞質皺縮，體積變小，細胞的折光性變差。1.0μg·mL－1YLSP組：細胞接近空白對照組，細胞個體飽滿，突觸較明顯，折光率較模型組好，胞漿較透亮。結果見圖1。

圖1 YLSP對Aβ25－35所致PC12細胞損傷的保護作用（×100）A.空白對照組；B.模型組；C.1.0μg·mL－1 YLSP組Fig 1 Protective effects of YLSP on the Aβ25－35－induced cytotoxicity in PC12 cells（×100）A.normal group；B.model group；C.1.0μg·mL－1 YLSP group

3.2 透射電鏡觀察結果 空白對照組：PC12細胞電子密度均勻，微絨毛發(fā)達，細胞核圓，核仁大而明顯，核質分布均勻，核邊緣圓滑，胞質內(nèi)可見平行雙層膜粗面內(nèi)質網(wǎng)、游離核糖體、溶酶體及數(shù)量較多的線粒體，線粒體嵴清晰可見，各細胞器均結構正常清晰（圖2）。模型組：細胞膜微絨毛消失，胞核核形不規(guī)則，核膜明顯凹陷，核仁邊聚，核質分布不均，染色質濃縮分布在核膜周圍或一側，線粒體數(shù)量明顯變少，結構不清，出現(xiàn)了腫脹、空泡樣變及嵴斷裂，內(nèi)質網(wǎng)囊腔膨脹擴張成池，但胞膜完整（圖3）。1.0μg·mL－1YLSP 組：細胞接近空白對照組，細胞膜上微絨毛較空白對照組稍少，核膜略凹陷，核仁明顯，核質分布均勻，線粒體數(shù)目多且形態(tài)正常，但個別粗面內(nèi)質網(wǎng)囊腔膨脹擴大（圖4）。

圖2 空白對照組細胞的超微結構（A×15 000，B×30 000）Fig 2 The ultrastructure of normal cells（A×15 000，B×30 000）

4 討論

AD 典型的神經(jīng)病理學特征是老年斑（senior patch，SP）的 出 現(xiàn)。β－淀 粉 樣 蛋 白（amyloid betaprotein，Aβ）是老年斑的主要成分，細胞外纖維化的Aβ聚集，以及細胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結（neurofibroustackles，NFT），最終形成了老年斑［6］。Aβ是由β－淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）裂解而成的毒性蛋白，由3943個氨基酸殘基組成，其活性片段主要在第2535個氨基酸殘基（GSNKGAI－IGLM），其在腦內(nèi)沉積與AD 形成密切相關［7］。PC12細胞是來自大鼠嗜鉻細胞瘤的細胞株，系神經(jīng)嵴源性，具有神經(jīng)細胞的特點，可傳代培養(yǎng)，生長條件穩(wěn)定［8］。因此，用Aβ25－35直接誘導PC12細胞凋亡以建立AD 模型，具有代表性，是體外進行AD 研究的理想模型。在本實驗中，采用Aβ25－35誘導PC12細胞損傷凋亡模型，給予YLSP預處理后，MTT 比色法分析細胞存活率，倒置相差顯微鏡、透射電鏡觀察細胞形態(tài)改變，以觀察藥物的保護作用。MTT 法顯示與空白對照組相比較，加入10μmol·L－1Aβ25－35損傷因素后，細胞存活率顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，YLSP各濃度組均使細胞存活率顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。倒置相差顯微鏡觀察結果顯示：模型組PC12細胞可見細胞膜外圍的突觸回縮甚至消失，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，細胞聚集成團，數(shù)量明顯減少，大多數(shù)細胞由多邊形變成不規(guī)則形狀和圓形，細胞質皺縮，體積變小，細胞的折光性變差。YLSP治療后細胞接近空白對照組，細胞個體飽滿，突觸較明顯，折光率較模型組好，胞漿較透亮。透射電鏡超微形態(tài)學觀察顯示模型組PC12 細胞核縮小，異染色質邊集，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡狀結構，溶酶體增多，伴有線粒體腫脹明顯，有的嵴斷裂，有的空泡變性，滑面內(nèi)質網(wǎng)擴張，粗面內(nèi)質網(wǎng)輕度擴張并有脫顆?，F(xiàn)象，YLSP 治療后對細胞超微結構有所改善，細胞結構接近正常。

綜上可知，YLSP可顯著改善Aβ25－35誘導引起的PC12細胞形態(tài)的改變，減輕細胞膜的損傷，增強細胞的活力，提高神細胞的存活率，具有一定的對抗Aβ25－35誘導的PC12細胞凋亡作用。其他實驗結果也顯示，YLSP與清除腦內(nèi)自由基及提高抗氧化能力有關［4］。提示YLSP對AD 的作用機制可能是多方面的，將其用于AD的治療還有待于進一步的研究。

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