田 斌，段績(jī)輝，徐明忠，張 兵，廖 瑜，申曉君，文 嵐

(長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙410001)

卵形瘧原蟲(chóng)(plasmodium ovale)是感染人類(lèi)的瘧原蟲(chóng)，首次發(fā)現(xiàn)最有可能是在1900年[1]。因其感染患者具有間日發(fā)熱等特點(diǎn)，一直被認(rèn)為是間日瘧原蟲(chóng)(plasmodium vivax)的變種，直到1922年Stephens[2]才對(duì)該種瘧原蟲(chóng)進(jìn)行了完整的形態(tài)描述和命名。目前其地理分布局限在熱帶非洲、中東、巴布亞新幾內(nèi)亞、印度尼西亞的西伊里安查亞省和東南亞地區(qū)[3]。我國(guó)對(duì)卵形瘧的報(bào)道極為鮮見(jiàn)。隨著國(guó)際間交流的不斷擴(kuò)大與加深，輸入性瘧疾病例的數(shù)量也呈逐年增加的態(tài)勢(shì)[4]，給國(guó)內(nèi)大部分瘧疾消除地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室診斷工作提出了新的挑戰(zhàn)。我們分析了3例輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室診斷，以提示檢測(cè)人員應(yīng)警惕卵形瘧的誤診與漏診。

材料和方法

一、標(biāo)本來(lái)源

標(biāo)本為3例輸入性卵形瘧患者的靜脈抗凝血，制作厚薄血膜涂片后－70℃凍存?zhèn)錂z。病例情況如下:患者A，男，44歲，剛果(布)務(wù)工，2012年1月18日回國(guó)，回國(guó)至本次發(fā)病期間無(wú)外出史，本次發(fā)病日期2012年4月25日，癥狀為畏寒、發(fā)熱(39.9℃，不規(guī)則)、發(fā)冷伴腹瀉。該患者曾于2011年4月在剛果(布)發(fā)病，境外醫(yī)療機(jī)構(gòu)未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，予青蒿素類(lèi)注射劑治療3 d后癥狀消失;患者B，男，22歲，塞拉利昂務(wù)工，2012年12月4日回國(guó)，回國(guó)至本次發(fā)病期間無(wú)外出史，本次發(fā)病日期2012年12月27日，癥狀為發(fā)熱(38.4℃，不規(guī)則)、發(fā)冷、出汗，曾于2012年6月在境外出現(xiàn)類(lèi)似癥狀，未行實(shí)驗(yàn)室檢查，予青蒿素類(lèi)注射劑治療3 d后癥狀消失;患者C，男，25歲，尼日利亞黑人，發(fā)病前3周入境，于2012年12月31日發(fā)病，癥狀為發(fā)熱且時(shí)間不規(guī)則，否認(rèn)既往患過(guò)瘧疾。

二、試劑與儀器

Giemsa染液為實(shí)驗(yàn)室自配;DNA提取試劑為QIAamp DNA Micro Kit;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑為Invitrogen公司Platinum PCR SuperMix;顯微照相系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)為英國(guó)SYNGENE公司產(chǎn)品。

三、方法

1.厚、薄血膜涂片檢查 按張進(jìn)順等[5]描述的方法進(jìn)行制作厚、薄血膜涂片，行Giemsa染色后顯微鏡檢查并照相。

2.核酸擴(kuò)增及序列分析 采用巢氏PCR對(duì)瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，按文獻(xiàn)[6-8]提供序列由Invitrogen公司合成引物，見(jiàn)表1。第1輪擴(kuò)增體系為上下游引物(10 μmol/L)各 1μL，Platinum PCR SuperMix 18μL，DNA 模板5μL，計(jì)25μL體系;第2輪擴(kuò)增體系為上、下游引物(10 μmol/L)各 1μL，Platinum PCR SuperMix 16μL，以第1輪反應(yīng)產(chǎn)物1μL作為模板，補(bǔ)去離子水至25μL，各種特異性引物分別加入體系，不共用體系。擴(kuò)增條件第1輪和第2輪相同，均為95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72℃ 90 s，36個(gè)循環(huán);72℃ 5 min，1個(gè)循環(huán);4℃，∞。擴(kuò)增完成后對(duì)第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。產(chǎn)物測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成。

表1 巢氏PCR擴(kuò)增18S rRNA基因引物序列

結(jié) 果

一、厚薄血膜涂片鏡檢結(jié)果

厚血膜中卵形瘧原蟲(chóng)除滋養(yǎng)體以外各期原蟲(chóng)均為圓形或卵圓形;數(shù)目不等的細(xì)胞核較為明顯，呈紫紅色;細(xì)胞質(zhì)濃郁，呈深藍(lán)色;偶見(jiàn)紅色較粗大的紅色薛氏點(diǎn)(Schuffner's dot)和黃棕色的瘧色素。薄血膜中，被卵形瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞可呈卵圓形、梭形或淚滴形;略脹大;邊緣不整齊呈鋸齒狀或一端似掃帚狀等。滋養(yǎng)體階段細(xì)胞核粗大明顯呈紫紅色;胞漿粗壯，可有空泡，亦可出現(xiàn)阿米巴樣偽足;裂殖體階段蟲(chóng)體呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核呈分裂狀，成熟的裂殖體一般含有6～12個(gè)裂殖子排列成環(huán)狀或不規(guī)則串狀。配子體階段蟲(chóng)體呈圓形或橢圓形;胞漿均勻;細(xì)胞核1個(gè)，位于蟲(chóng)體的邊緣或中央。薛氏點(diǎn)可存在被各階段原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞內(nèi)，包括早期滋養(yǎng)體，較明顯。瘧色素呈黃棕色粒狀或短桿狀;常出現(xiàn)在成熟滋養(yǎng)體及以后各發(fā)育階段，隨蟲(chóng)體的發(fā)育量增加;在裂殖體階段集中，在配子體階段相對(duì)分散。見(jiàn)圖1。

二、巢氏PCR結(jié)果

患者A為卵形瘧原蟲(chóng)感染;患者B為卵形、惡性瘧原蟲(chóng)混合感染;患者C為卵形、間日瘧原蟲(chóng)混合感染。見(jiàn)圖2。

圖1 患者外周血涂片中的原蟲(chóng)

圖2 3例患者巢氏PCR擴(kuò)增結(jié)果

三、患者A擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

本研究對(duì)患者A卵形瘧原蟲(chóng)特異性條帶進(jìn)行了測(cè)序。由于采用的是巢氏PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，存在產(chǎn)物不單一情況，遂取中間無(wú)套峰的600 bp(見(jiàn)圖3)采用NCBI Blast工具進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示與 Sequence ID:gb|HQ697267.1/gb|HQ697266.1/dbj|AB182490.1 等卵形瘧原蟲(chóng) 18S rRNA基因序列的同源性為100%。

圖3 患者A的測(cè)序結(jié)果

討 論

本研究所檢出的3例卵形瘧患者的輸入地均為非洲中西部有卵形瘧原蟲(chóng)流行的國(guó)家[9-11]，其中2例患者在國(guó)外有瘧疾的既往史，另1例患者為瘧疾流行區(qū)居民?；颊逜薄血膜(首診醫(yī)療機(jī)構(gòu)未制作厚血膜)初次檢查結(jié)果為未檢出瘧原蟲(chóng)，但由于其具有瘧疾流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)，因此對(duì)其標(biāo)本進(jìn)行了巢氏PCR擴(kuò)增，當(dāng)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，回顧閱片時(shí)才發(fā)現(xiàn)確有卵形瘧原蟲(chóng)的滋養(yǎng)體和裂殖體，出現(xiàn)首次形態(tài)學(xué)檢查假陰性可能與患者帶蟲(chóng)密度較低和鏡檢人員不熟練有關(guān);患者B的厚、薄血膜上，具有形態(tài)學(xué)上非常典型的卵形和惡性瘧原蟲(chóng)形態(tài)，不容易產(chǎn)生漏診，兩種檢查方法結(jié)果一致;患者C形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果較巢氏PCR漏診了間日瘧原蟲(chóng)的感染，由于間日瘧原蟲(chóng)和卵形瘧原蟲(chóng)形態(tài)上的相似，使得此類(lèi)混合感染的診斷極為困難，需仔細(xì)檢查才可以避免?？梢?jiàn)瘧原蟲(chóng)顯微鏡檢查方法的局限性、混合感染及罕見(jiàn)蟲(chóng)種(卵形瘧在瘧疾流行最為嚴(yán)重的非洲其感染患者占瘧疾病例的比例也很少超過(guò)10.5%[12]，中國(guó)則無(wú)本地感染病例，輸入性的卵形瘧也罕見(jiàn))的出現(xiàn)使輸入性瘧疾的實(shí)驗(yàn)室診斷具有一定難度。目前國(guó)內(nèi)在瘧疾實(shí)驗(yàn)室診斷上具有豐富經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員斷檔，也是輸入性瘧疾病例漏診和誤診的原因之一[13-16]。因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)瘧疾消除地區(qū)瘧原蟲(chóng)形態(tài)學(xué)檢查技術(shù)培訓(xùn)，推廣分子生物學(xué)檢查技術(shù)的應(yīng)用，減少輸入性卵形瘧實(shí)驗(yàn)室檢查的誤診與漏診。

卵形瘧原蟲(chóng)雖在形態(tài)上同間日和三日瘧原蟲(chóng)有一定的區(qū)別，但這種區(qū)別不僅需要閱片經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)還受藥物、血標(biāo)本類(lèi)型及操作等多種因素影響。被寄生紅細(xì)胞脹大與否及脹大程度是卵形瘧與三日、間日瘧原蟲(chóng)鑒別要點(diǎn)，但細(xì)胞脹大是相對(duì)的，當(dāng)采用不新鮮抗凝標(biāo)本時(shí)這種相對(duì)脹大就很難發(fā)現(xiàn);紅細(xì)胞邊緣形態(tài)也是鑒別點(diǎn)之一，也會(huì)受制片和滲透壓等因素影響，這種影響甚或?qū)е屡袛噱e(cuò)誤;薛氏點(diǎn)、齊氏點(diǎn)和瘧色素等受標(biāo)本新鮮度和染色質(zhì)量的影響更大，標(biāo)本陳舊、染色不佳時(shí)可能根本無(wú)法觀察到這些特點(diǎn);裂殖子的數(shù)目和排列形態(tài)及瘧原蟲(chóng)胞漿的特點(diǎn)雖也可作為上述3種瘧原蟲(chóng)鑒別的要點(diǎn)，但其之間存在不同程度的交叉(裂殖子數(shù)目:間日瘧原蟲(chóng)12～24個(gè)，卵形瘧原蟲(chóng)和三日瘧原蟲(chóng)為6～12個(gè);胞漿空泡3種瘧原蟲(chóng)均可出現(xiàn)，間日瘧原蟲(chóng)和卵形瘧原蟲(chóng)還可出現(xiàn)偽足)。

一般認(rèn)為卵形瘧原蟲(chóng)的潛伏期為10～17 d，發(fā)作癥狀較輕，很少?gòu)?fù)發(fā)，多在6～10次發(fā)作后自愈[3]，這可能與卵形瘧原蟲(chóng)僅感染網(wǎng)織紅細(xì)胞，其原蟲(chóng)血癥一般限制在2% ～5%的紅細(xì)胞內(nèi)[17]有關(guān)。而本研究中患者A在無(wú)瘧疾流行區(qū)居留時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)潛伏期。因此，該患者可能是復(fù)發(fā)病例，也不排除少數(shù)卵形瘧潛伏期更長(zhǎng)，或該患者期間有過(guò)瘧疾發(fā)作，由于癥狀較輕而被忽視的可能。患者C為卵形和間日瘧原蟲(chóng)的混合感染。間日瘧在紅細(xì)胞膜上的受體是Duffy血型抗原。而西非黑人和美國(guó)黑人Duffy血型陰性[18]，缺少間日瘧受體決定簇，故間日瘧原蟲(chóng)不能侵入這類(lèi)紅細(xì)胞寄生，可以說(shuō)Duffy血型陰性的人群對(duì)間日瘧原蟲(chóng)存在天然抵抗[3]。因此，在西非黑人似乎不應(yīng)該存在卵形和間日瘧原蟲(chóng)的混合感染。所以患者C的Duffy血型及產(chǎn)生此類(lèi)混合感染的現(xiàn)象值得進(jìn)一步研究。而 Purnomo等[19]曾報(bào)道1例四重瘧疾感染的病例和在瘧疾高度流行區(qū)域健康帶蟲(chóng)者同時(shí)感染3～4種瘧原蟲(chóng)并不罕見(jiàn)的事實(shí)又使卵形和間日瘧原蟲(chóng)的混合感染可以解釋。

聯(lián)合國(guó)千年發(fā)展目標(biāo)提出在全球根除瘧疾倡議。衛(wèi)生部等13部委制定和頒布了“中國(guó)消除瘧疾行動(dòng)計(jì)劃(2010～2020年)”。加強(qiáng)瘧疾消除地區(qū)瘧原蟲(chóng)形態(tài)學(xué)檢查技術(shù)培訓(xùn)及推廣分子生物學(xué)檢查寄生蟲(chóng)技術(shù)的應(yīng)用，減少輸入性卵形瘧實(shí)驗(yàn)室檢查的誤診與漏診十分必要。

[1]Craig CF.New varieties and species of malaria plasmodia[J].J Parasitology，1914，1(2):85-94.

[2]Stephens JWW.A new malaria parasite of man[J].Ann Trop Med Parasitol，1922，87(14):383-388.

[3]張進(jìn)順，李 薇，孫 新，等.診斷醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:109-138.

[4]湯林華，王汝波，王建軍，等.輸入性瘧疾的診治與管理[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2010:22-28.

[5]張進(jìn)順，高興政.臨床寄生蟲(chóng)檢驗(yàn)學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:103-109.

[6]Snounou G，Viryakosol S，Zhu XP，et al.High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction[J].Mol Biochem Parasitol，1993，61(2):315-320.

[7]Snounou G，Viriyakosol S，Jarra W，et al.Identification of the four human malaria parasite species in field samples bythe polymerase chain reaction and detection of high prevalence of mixed infections[J].Mol Biochem Parasitol，1993，58(2):283-292.

[8]Singh B，Bobogare A，Cox-Singh J，et al.A genusand species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies[J].Am J Trop Med Hyg，1999，60(4):687-692.

[9]Carme B，Kenmogne D，Copin N，et al.Plasmodium prevalence and parasitic burden in blood donors of Brazzaville，Congo[J].Ann Soc Belg Med Trop，1993，73(3):179-187.

[10]Gbakima AA.Inland valley swamp rice development:malaria，schistosomiasis，onchocerciasisin south central Sierra Leone[J].Public Health，1994，108(2):149-157.

[11]May J，Mockenhaupt FP，Ademowo OG，et al.High rate of mixed and subpatent malarial infections in southwest Nigeria[J].Am J Trop Med Hyg，1999，61(2):339-343.

[12]Gutman J，Guarner J.Pediatric malaria:8-year case series in Atlanta，Georgia，and review of the literature[J].J Travel Med，2010，17(5):334-338.

[13]Rantala AM，Taylor SM，Trottman PA，et al.Comparison of real-time PCR and microscopy for malaria parasite detection in Malawian pregnant women[J].Malar J，2010，9:269.

[14]Ndao M，Bandyayera E，Kokoskin E，et al.Comparison of blood smear，antigen detection，and nested-PCR methods for screening refugees from regions where malaria is endemic after a malaria outbreak in Quebec，Canada[J].J Clin Microbiol，2004，42(6):2694-2700.

[15]師永霞，黃吉城，蘇錦坤，等.1例國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)的輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011，27(10):914-917.

[16]段績(jī)輝，王郭清，張湘君，等.發(fā)病不穩(wěn)定地區(qū)瘧疾誤診原因分析[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7(7):1111-1112.

[17]Collins WE，Jeffery GM.Plasmodium ovale:parasite and disease[J].Clin Microbiol Rev，2005，18(3):570-581.

[18]王 晨，陳和平，岳丹琪，等.上海地區(qū)人群中部分稀有血型篩選[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2007，22(5):583-584.

[19]Purnomo，Solihin A，Gomez-Saladin E，et al.Rare quadruple malaria infection in Irian Jaya Indonesia[J].J Parasitol，1999，85(3):574-579.