曾長(zhǎng)青 黃良祥 黃海嘯 陳林昊 鄭 羽 池良杰

胃癌（gastric cancer）起源于胃壁最表層的黏膜上皮細(xì)胞，其中腺癌約占90%。全世界每年大約新發(fā)胃癌100余萬(wàn)，中國(guó)占42%，死亡約80萬(wàn)，中國(guó)占35%，是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一，發(fā)病率和死亡率均是世界平均水平2倍多［1］。Fbxw7（F-box and WD repeat domain-containing 7；也稱(chēng) Fbw7、SEL-10、hCdc4和hAgo）是Skp1-Cul1-F-box（SCF）類(lèi)泛素連接酶E3復(fù)合體中特異性識(shí)別底物的關(guān)鍵因子，能夠靶向降解Cyclin E，c-Myc，c-Jun和Notch等癌蛋白，是一種廣泛的抑癌基因［2］。在許多種人類(lèi)惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Fbxw7表達(dá)缺失，同時(shí)，研究證實(shí)下調(diào)Fbxw7基因表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［3］，而在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Fbxw7可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。本實(shí)驗(yàn)初步探討Fbxw7在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為胃癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織來(lái)源于福建省立醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本共20例，其中男14例，女6例，年齡31～68（50±3.5）歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療，所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為胃腺癌。所有標(biāo)本于術(shù)中離體30 min內(nèi)取材，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片備用。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃腺癌細(xì)胞系MGC-803和AZ521均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，MGC-803表達(dá)Fbxw7相對(duì)較低，AZ521表達(dá)Fbxw7相對(duì)較高。細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2～3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）和苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)自Sigma公司；β-巰基乙醇購(gòu)自Boehinger公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司；質(zhì)粒小提試劑盒和慢病毒包裝試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；Fbxw7抗體購(gòu)自Abcam公司；c-Myc和Cyclin E抗體購(gòu)自CST公司；β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 對(duì)石蠟塊進(jìn)行4 μm連續(xù)切片制片。經(jīng)過(guò)脫蠟過(guò)程后，進(jìn)行熱抗原修和內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，100 mL/L山羊血清封閉，1∶100稀釋的Fbxw7一抗4℃孵育過(guò)夜。以PBS取代一抗為陰性對(duì)照。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗鼠二抗工作液，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，滴加DAB顯色，蘇木蘇輕度復(fù)染，梯度脫水至透明。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照。采用染色強(qiáng)度聯(lián)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：染色強(qiáng)度分為4等級(jí)：0分，陰性；1分，弱陽(yáng)性；2分，中度；3分，強(qiáng)陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞百分比分級(jí)如下：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘≥1分則認(rèn)為Fbxw7蛋白陽(yáng)性表達(dá)［3］。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Fbxw7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒（EV）、Fbxw7 shRNA和陰性對(duì)照shRNA（NT-shRNA）由Kanae Yumimoto教授惠贈(zèng)（Department of Molecular and Cellular Biology，Medical Institute of Bioregulation，Kyushu University）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照 Effectene?Transfection Reagent說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，4℃下110 V電壓濕轉(zhuǎn)1.5 h。5%脫脂奶粉（TBST溶解）室溫封閉，加入1∶1 000稀釋的Fbxw7、c-Myc和Cyclin E抗體以及1∶10 000稀釋的β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜，加入適當(dāng)（1∶2 500）濃度的二抗，室溫孵育2 h。暗室內(nèi)浸入ECL液顯色，并使膠片曝光，全自動(dòng)X光洗片機(jī)洗片。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 離心、收集轉(zhuǎn)染12 h的細(xì)胞，，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約為2×105/mL，以200 μL/孔接種于96孔板。96孔板的左上孔設(shè)為空白孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加5 mg/mL MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，棄上清，加DMSO 150 μL/孔，37℃振搖孵育20 min至顆粒溶解。酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔490 nm的吸光度（OD490），分析各組細(xì)胞活性。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞1次，再用胰酶消化液解離細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞。用PBS重新懸浮細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。取1～5×105細(xì)胞懸浮液，1 500 r/min，5 min離心后棄上清液，加入500 μL的1×結(jié)合緩沖液。加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL碘化丙啶，移液器輕輕吹打混勻。室溫下避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Fbxw7在胃癌組織中低表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Fbxw7在20例胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fbxw7在胃癌組織中的表達(dá)水平（1.24±0.23）顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（7.68±2.13）（n=20，t=8.456，P=0.004）；Fbxw7蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)和胞膜中（圖1）。

圖1 Fbxw7在胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的免疫組織化學(xué)染色 （SP×400）Figure1 Immunohistochemical staining of Fbxw7 in gastric cancer tissues and normal tumor-adjacent tissues （SP×400）

2.2 過(guò)表達(dá)Fbxw7下調(diào)c-Myc和Cyclin E蛋白表達(dá)

采用Fbxw7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后的MGC-803細(xì)胞中Fbxw7及其靶蛋白c-Myc和Cyclin E的表達(dá)，結(jié)果顯示Fbxw7蛋白表達(dá)明顯升高并伴隨c-Myc和Cyclin E明顯降低（圖2）。

2.3 過(guò)表達(dá)Fbxw7降低細(xì)胞增殖能力

采用MTT法連續(xù)檢測(cè)Fbxw7過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示相對(duì)于空質(zhì)粒（EV）轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，F(xiàn)bxw7過(guò)表達(dá)后MGC-803細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P＜0.05，圖3）。

2.4 過(guò)表達(dá)Fbxw7誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fbxw7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，結(jié)果顯示Fbxw7過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡較空質(zhì)粒（EV）組顯著增加（P＜0.05，圖4）。

2.5 敲低Fbxw7導(dǎo)致c-Myc和Cyclin E蛋白蓄積

Fbxw7 shRNA轉(zhuǎn)染AZ521細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)Fbxw7及其靶蛋白c-Myc和Cyclin E的表達(dá)，結(jié)果顯示Fbxw7蛋白表達(dá)明顯降低并伴隨c-Myc和Cyclin E蛋白蓄積（圖5）。

2.6 敲低Fbxw7增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力

采用MTT法連續(xù)檢測(cè)敲低Fbxw7對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示相對(duì)于陰性對(duì)照（NT-shRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，敲低Fbxw7后AZ521細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05，圖6）。

圖2 MGC-803細(xì)胞過(guò)表達(dá)Fbxw7導(dǎo)致c-Myc和Cyclin E蛋白表達(dá)下調(diào)Figure2 Fbxw7 overexpression leads to downregulation of c-Myc and Cyclin E protein expression in MGC-803 cells

圖3 過(guò)表達(dá)Fbxw7降低MGC-803細(xì)胞增殖能力Figure3 Fbxw7 overexpression decreases MGC-803 cell proliferation

圖4 過(guò)表達(dá)Fbxw7誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡Figure4 Fbxw7 overexpression induces MGC-803 cell apoptosis

圖5 敲低AZ521細(xì)胞中Fbxw7表達(dá)導(dǎo)致c-Myc和Cyclin E蛋白表達(dá)上調(diào)Figure5 Fbxw7 knockdown leads to accumulation of c-Myc and Cyclin E protein in AZ521 cells

圖6 敲低Fbxw7增強(qiáng)AZ521細(xì)胞增殖能力Figure6 Fbxw7 knockdown increases AZ521 cell proliferation

2.7 敲低Fbxw7減少細(xì)胞凋亡

AZ521細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fbxw7 shRNA 48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，結(jié)果顯示Fbxw7 shRNA組細(xì)胞凋亡較陰性對(duì)照（NT-shRNA）組顯著減少（P＜0.05，圖7）。

圖7 敲低Fbxw7減少AZ521細(xì)胞凋亡Figure7 Fbxw7 knockdown decreases AZ521 cell apoptosis

3 討論

靶蛋白的泛素化是由功能連續(xù)的三個(gè)酶介導(dǎo)的：泛素激活酶（E1）、泛素載體蛋白酶（E2）和泛素連接酶（E3）。泛素化底物被26S蛋白酶體選擇性的識(shí)別和降解［5］。SCF類(lèi)E3復(fù)合體是泛素連接酶（E3）中的一類(lèi)，由環(huán)指蛋白（ring-box 1，Rbx1；也稱(chēng)Roc1和Hrt1）、支架蛋白（cullin1，Cul1）、銜接蛋白（S-phase kinase-associated protein 1，Skp1）和一個(gè) F-box蛋白組成，其中F-box蛋白類(lèi)決定底物特異性［6］。Fbxw7是F-box蛋白家族的一員，對(duì)漂亮新小桿線蟲(chóng)進(jìn)行遺傳分析時(shí)，F(xiàn)bxw7作為L(zhǎng)IN-12介導(dǎo)（Notch介導(dǎo)）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子首次被發(fā)現(xiàn)。Fbxw7在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也與Notch家族蛋白類(lèi)相互作用，促進(jìn)其泛素依賴(lài)的更新［7］。而且Fbxw7靶向降解數(shù)個(gè)控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白，包括CyclinE、c-Myc和c-Jun，同時(shí) SREBPs（sterol regulatory element binding protein）、mTOR（mammalian target of rapamycin）和PGC-1α（PPARγ-coactivator-1α）等不直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白也通過(guò)Fbxw7靶向降解［8］。

CyclinE、c-Myc、c-Jun和Notch都是原癌基因的產(chǎn)物，F(xiàn)bxw7能促進(jìn)這些癌蛋白的降解，因此被認(rèn)為是一種廣泛的腫瘤抑制因子［9］。Yakobori等［10］發(fā)現(xiàn)Fbxw7低表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和不良預(yù)后相關(guān)，而且Fbxw7低表達(dá)合并p53突變的胃癌患者具有不同的預(yù)后不良，提示協(xié)同破壞p53和Fbxw7促進(jìn)腫瘤患者預(yù)后不良。另外6%前列腺癌中存在Fbxw7基因位點(diǎn)修飾，F(xiàn)bxw7亞型差異表達(dá)與前列腺癌高分期和復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)［11］。另外一個(gè)團(tuán)隊(duì)也證實(shí)Fbxw7突變導(dǎo)致的Cyclin E高表達(dá)在胰腺癌發(fā)展中發(fā)揮決定性作用［12］。這些結(jié)果提示Fbxw7在多種人類(lèi)腫瘤發(fā)生中作為腫瘤抑制基因發(fā)揮功能。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)Fbxw7在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，這與之前的相關(guān)報(bào)道一致［10，13-15］。在許多種人類(lèi)惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Fbxw7表達(dá)缺失，包括急性T細(xì)胞型淋巴細(xì)胞白血病、膽管上皮癌、胰腺癌、肝癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌［3］。p53可以直接調(diào)控Fbxw7表達(dá)［16］，但0～77%的胃癌組織中存在p53突變［17］，而且研究表明6%胃癌組織中存在Fbxw7基因突變［9］，以上兩種機(jī)制可能是導(dǎo)致胃癌中Fbxw7低表達(dá)的原因。Fbxw7調(diào)控多種癌蛋白的表達(dá)，但在胃癌中其具體的調(diào)控靶點(diǎn)和相關(guān)通路尚不清楚，國(guó)外研究證實(shí)應(yīng)用特異性Fbxw7 siRNA下調(diào)Fbxw7基因表達(dá)可以導(dǎo)致c-Myc和Cyclin E蓄積并促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖［13］。本研究在胃癌MGC-803細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Fbxw7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fbxw7下調(diào)c-Myc和Cyclin E蛋白表達(dá)水平，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在AZ521細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Fbxw7 shRNA后，導(dǎo)致c-Myc和Cyclin E蛋白蓄積，并伴隨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和凋亡減少。c-Myc在有絲分裂信號(hào)通路和細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，Cyclin E是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵組分，兩者在胃癌組織中都表達(dá)失調(diào)［18-19］。結(jié)合以上結(jié)論推測(cè)Fbxw7在胃癌中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮功能，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc和Cyclin E的表達(dá)介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控。

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