陳士恒, 章 晴, 史曉梅, 楊永壇

(中糧營養(yǎng)健康研究院/北京市營養(yǎng)健康與食品安全重點實驗室,北京 100020)

超聲提取-分散固相萃取-氣相色譜法測定綠茶中有機磷類農(nóng)藥殘留

陳士恒, 章 晴, 史曉梅, 楊永壇*

(中糧營養(yǎng)健康研究院/北京市營養(yǎng)健康與食品安全重點實驗室,北京 100020)

應(yīng)用超聲輔助提取和分散固相萃取前處理方法結(jié)合氣相色譜(配火焰光度檢測器)建立了綠茶中13種有機磷類農(nóng)藥殘留的快速分析方法.5 g茶葉樣品用20 mL乙腈(含1%乙酸)超聲輔助提取后,以石墨化炭黑與伯仲胺混合型固相分散凈化,高速離心后氮吹濃縮復(fù)溶,過濾膜,用氣相色譜-火焰光度檢測器進(jìn)行檢測.在0.02～0.10mg/kg的添加水平,13種有機磷農(nóng)藥的平均回收率是84.78%～116.72%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.12%～9.32%,檢出限是0.000 8～0.01 mg/kg.本方法簡便快速,準(zhǔn)確性好,成本低,該方法已用于市面上銷售的綠茶產(chǎn)品中有機磷類農(nóng)藥殘留測定,結(jié)果均低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2012的最大殘留量要求.

有機磷農(nóng)藥;超聲波提取;分散固相萃取;氣相色譜;綠茶

有機磷類農(nóng)藥是我國使用范圍最廣、用量最大的一類廣譜、高效的農(nóng)藥.當(dāng)前,茶葉中農(nóng)藥殘留超限量已成為我國茶葉出口歐盟、北美和日本等發(fā)達(dá)地區(qū)和國家的主要技術(shù)性貿(mào)易壁壘[1-2].茶葉分發(fā)酵茶和不發(fā)酵茶,其中綠茶屬于不發(fā)酵茶,含有較多的嘌呤類生物堿、糖類、色素、維生素和礦物質(zhì)[3-5],基質(zhì)復(fù)雜,對痕量的農(nóng)藥殘留檢測有嚴(yán)重干擾.目前,國內(nèi)外研究茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法主要有索氏提取、振蕩提取、超聲提取、加速溶劑萃取、分散液液微萃取、固相萃取、分散固相萃取、凝膠滲透色譜等方法[6-10].其中分散固相萃取也稱QuEChERS方法,是在2003年由Anastassiades和Lehotay等[11]開發(fā)的樣品前處理技術(shù),因分散固相萃取法具有快速(quick)、簡單(easy)、便宜(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)和安全(safe)的特點,而得名QuEChERS方法.分散固相萃取法也被用于茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測[12-14],多采用氣相色譜-質(zhì)譜法或液相色譜-質(zhì)譜法[15-16],但結(jié)合氣相色譜-火焰光度檢測器(GC-FPD)檢測的應(yīng)用未見報道.

本實驗采用超聲波輔助提取,提高了有機磷農(nóng)藥的提取效率,結(jié)合分散固相萃取方法去除綠茶中的共提基質(zhì),再用氮吹提高方法的檢出限,最后采用氣相色譜火焰光度檢測器法測定13種有機磷類農(nóng)藥,取得了較好的效果.與傳統(tǒng)方法相比,該方法提高了分析速度和效率,也提高了檢測靈敏度,重復(fù)性好且回收率高,定量準(zhǔn)確,操作簡便,非常適合在基層企業(yè)進(jìn)行推廣.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品包括:敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、久效磷、樂果、甲基對硫磷、殺螟硫磷、對硫磷、水胺硫磷、三唑磷、苯硫磷、伏殺硫磷.無水氯化鈉、無水乙酸鈉和乙酸,均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)、伯仲胺(primary secondary amine,PSA),博納艾杰爾公司.

茶葉樣品購自市場.

1.2 儀器與設(shè)備

7890A型氣相色譜儀(配超高惰性襯管、FPD檢測器和Open Lab CDS for Chemstation工作站),美國安捷倫科技有限公司;TG 16-II型臺式高速離心機,長沙平凡儀器儀表;BSA 224S-CW型電子天平,德國賽多利斯集團(tuán);SB-3200 DTDN型超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HGC-24A型氮吹儀,天津恒奧科技發(fā)展有限公司;QL-902型旋渦混合器,海門其林貝爾儀器制造有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取13種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品,用甲苯-丙酮混合溶液配制成1mg/m L的單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18℃條件下儲存.

逐一吸取一定體積的單個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別注入同一容量瓶中,用丙酮稀釋至刻度,配制成10 mg/L的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20℃條件下儲存.

1.3.2 色譜條件

色譜柱為DB-35 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm,安捷倫公司);程序升溫是100℃保持1 min,然后以8℃/min升溫至300℃,保持19min;載氣為高純氮氣,恒流模式,流速為1.0 m L/min;進(jìn)樣口溫度為220℃;進(jìn)樣方式是不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量為2μL;檢測器溫度250℃,磷模式;H2流量是75 mL/min,空氣流量是100 mL/min.

1.3.3 前處理方法

取茶葉樣品粉碎并混合均勻,稱取5.00 g(精確至0.01 g),于50mL離心管中,加入20mL乙腈(含1%乙酸)提取溶液,然后加入2 g無水氯化鈉和2 g無水乙酸鈉,手動充分振蕩3min,然后超聲20min, 6 000 r/min離心5 min.取6 m L上清液于裝有300 mg GCB和120mg PSA的10mL離心管中,充分振蕩渦旋1min,6000 r/min離心3min,取4mL上層清液于刻度試管中,常溫條件下氮吹至1mL以下,使用丙酮定容至1.0mL,過0.25μm有機濾膜后上機檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

有機磷農(nóng)藥極性差別較大,如甲胺磷、乙酰甲胺磷、久效磷和氧樂果等極性較強,而苯硫磷和伏殺硫磷等極性則較弱,因此色譜柱優(yōu)化實驗選用Rtx-1、Rtx-1701和DB-35ms三種毛細(xì)管色譜柱,規(guī)格均為30m×0.25mm×0.25μm.

實驗結(jié)果表明,Rtx-1以交聯(lián)鍵合的100%聚二甲基硅氧烷為固定相,是非極性毛細(xì)管柱;Rtx-1701的固定相含交聯(lián)鍵合的14%氰基丙基苯基和86%二甲基聚硅氧烷;DB-35ms的固定相類似于含35%二苯基的聚二甲基硅氧烷,Rtx-1701和DB-35ms均是中等極性毛細(xì)管柱.實驗中發(fā)現(xiàn)Rtx-1對甲胺磷、乙酰甲胺磷、久效磷和氧樂果的峰形容易拖尾;Rtx-1701和DB-35ms對13種有機磷農(nóng)藥均有較好的分離能力,而DB-35ms毛細(xì)管柱具有更高的使用溫度,最高可達(dá)360℃,可在程序升溫過程中設(shè)置更高的爐箱溫度老化色譜柱,降低基質(zhì)中高沸點物質(zhì)對下一次分析造成的干擾.因此本實驗選擇DB-35ms作為色譜柱.

2.2 提取溶劑的選擇

實驗分別考察了20 mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸)、乙酸乙酯和V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)= 1∶1溶液3種提取溶劑的提取效果.

乙酸乙酯是中等極性溶劑,在提取一些極性較大的有機磷農(nóng)藥時回收率較差,且提取液呈較深的墨綠色,凈化后仍有一定的綠色.V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=1∶1溶液對基質(zhì)中的雜質(zhì)提取較少,對后續(xù)的凈化較為有利,但對乙酰甲胺磷、久效磷和氧樂果的提取率低,亦不太適合.乙腈是極性較強的溶劑,容易滲透至茶葉細(xì)胞組織中,增強了農(nóng)藥的提取率,對不同極性有機磷農(nóng)藥的回收率均能滿足農(nóng)藥殘留分析要求,且利于后面的凈化.同時乙腈中含體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸,提高了有機磷農(nóng)藥的穩(wěn)定性,因此實驗中均采用20mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸)提取.

2.3 提取方式的選擇

實驗過程中比較了振蕩提取、均質(zhì)提取和超聲波輔助提取三種常見提取方法.其中振蕩提取要達(dá)到較好回收率時所需的時間較長,一般需要40～60 min,效率較低.均質(zhì)提取可在短時間內(nèi),使溶劑和茶葉充分混合,提取效果較好,但需要價格較高的均質(zhì)機和刀頭,這種提取方法不適合在基層企業(yè)進(jìn)行推廣.而超聲輔助提取所采用的設(shè)備較為簡單低廉,所需時間小于30min,操作簡便,因此實驗中采用超聲輔助提取的方式.

2.4 凈化劑填料的用量

研究表明GCB能夠較好的去除色素和固醇類雜質(zhì),但同時也會對農(nóng)藥組分產(chǎn)生一定吸附[14],因此需要對GCB的用量進(jìn)行考察.

在茶葉樣品中添加有機磷農(nóng)藥混標(biāo),按照1.3的實驗方法,將GCB用量從70 mg增加到300 mg,考察有機磷農(nóng)藥的回收率變化,如圖1.

圖1 GCB用量對13種有機磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響Fig.1 Effects of different dosages of GCB on recoveries of 13 organphosphorous pesticides

從圖1中可看到GCB用量大于200mg時,久效磷、殺螟硫磷、三唑磷和伏殺硫磷的回收率已低于80%;當(dāng)GCB用量為200 mg,凈化后的溶液顏色為極淺的綠色,整體回收率較好,因此GCB的用量采用200mg.

PSA是一種弱陰離子交換吸附劑,能通過形成氫鍵去除脂肪酸、糖及其他基質(zhì)共萃取物[14].由于PSA同時存在伯胺、仲胺而具有更高的去雜質(zhì)能力.

在茶葉樣品中添加有機磷農(nóng)藥混標(biāo),按照1.3的實驗方法,將PSA用量從80mg增加到240mg,考察有機磷農(nóng)藥的回收率變化,如圖2.

從圖2可看到PSA用量大于120 mg時,甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧樂果的加標(biāo)回收率已小于80%, 當(dāng)PSA用量為120mg時,13種有機磷類農(nóng)藥的整體回收率最好.因此實驗中PSA用量均為120mg.

圖2 PSA用量對13種有機磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響Fig.2 Effects of different dosages of PSA on recoveries of 13 organphosphorous pesticide

2.5 方法的線性范圍和檢出限

在1.2的實驗方法下,13種有機磷類農(nóng)藥分離良好(見圖3).用空白茶葉樣品制備樣品空白提取液,作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液.將10 mg/L的混標(biāo)儲備液逐級稀釋為濃度是0.250,0.100, 0.050,0.020,0.010,0.005mg/L的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以13種有機磷農(nóng)藥的質(zhì)量濃度對相應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性方程及相關(guān)系數(shù).以信噪比(S/N)=3計算方法中各種有機磷農(nóng)藥的檢出限(LOD),以S/N=10計算方法中各種有機磷農(nóng)藥的定量限(LOQ),見表1.

圖3 13種有機磷農(nóng)藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram ofmatrix-match standard solutions of 13 organphosphorous pesticides

2.6 方法的加標(biāo)回收和精密度實驗

為考察方法的準(zhǔn)確度,按照1.3所確定的方法,在相應(yīng)線性范圍內(nèi)進(jìn)行了3個水平(0.02,0.05, 0.10mg/kg)的添加回收率試驗,每個水平做5個平行樣品測定,茶葉中13種有機磷農(nóng)藥的回收率均在80%～120%(見表2),各種有機磷農(nóng)藥的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%.

表1 13種有機磷農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.1 Linear equations,correlation coefficients,limit of detection,and limit of quantity of 13 organphosphorous pesticides

表2 13種有機磷農(nóng)藥添加實驗的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 Average spiked recoveries and relative standard deviations of 13 organophosphorus pesticides %

2.7 方法的應(yīng)用

為了驗證方法的可行性,應(yīng)用本方法對市場上購買的10個綠茶樣品進(jìn)行上述13種有機磷類農(nóng)藥的測定,結(jié)果見表3.實驗顯示有8個茶葉樣品被檢出農(nóng)藥殘留,但殘留量均低于GB 2763—2012中對茶葉農(nóng)藥最大殘留限量的規(guī)定,說明這10個茶葉產(chǎn)品是安全的.

表3 實際茶葉樣品檢測結(jié)果Tab.3 Determination results of tea samples from local supermarkets

3 結(jié) 論

建立了超聲輔助提取 分散固相萃取 氣相色譜檢法測綠茶中13種有機磷類農(nóng)藥殘留的方法,方法靈敏度能滿足國內(nèi)外食品安全標(biāo)準(zhǔn)中對茶葉的最大殘留限量要求.在0.02～0.10 mg/kg的添加水平, 13種有機磷農(nóng)藥的平均回收率是 84.78% ～116.72%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)是 0.12% ～9.32%,檢出限是0.000 8～0.01 mg/kg.本方法簡便快速,準(zhǔn)確性好,操作步驟少,采用GC-FPD作為QuEChERS技術(shù)后續(xù)的檢測方法,成本低廉,較適用于在基層企業(yè)進(jìn)行推廣.

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Determ ination of 13 Organophosphorus Pesticides Residues in Green Tea by Ultrasonic Assisted Extraction-Dispersive Solid Phase Extraction-Gas Chromatography

CHEN Shiheng, ZHANG Qing, SHIXiaomei, YANG Yongtan*
(COFCO Nutrition and Health Research Institute/Beijing Key Laboratory of Nutrition, Health and Food Safety,Beijing 100020,China)

Gas chromatography(with a FPD detector)was applied to the quick determination of 13 organophosphorus pesticides residues in green tea with sample pretreatment by ultrasonic assisted extraction and dispersive solid phase extraction.The sample(5 g)wasextracted with 20mL acetonitrile(containing 1%acetic acid)by ultrasonic,and the extract was purified by dispersive solid-phase extraction with graphitized carbon/primary secondary amine(GCB/PSA).After the high speed centrifugation,nitrogen flushing concentration,and filtration,the sample was detected by GC-FPD.At the fortification level from 0.02-0.10mg/kg,the average recovery of 13 organophosphorus pesticides was 84.78%-116.72%. Meanwhile,the relative standard deviation(n=3)was from 0.12%-9.32%and the limits ofdetection was 0.000 8-0.01 mg/kg.The method was simple,rapid,accurate,and low-cost with few impurity disturbs and suitable for organophosphorus pesticides detection in green tea.Thismethod was applied for the detection green teas in localmarkets,and the results of all organophosphorus pesticides were under themaximum residue limits of GB 2763—2012.

organophosphorus pesticides;ultrasonic extraction;dispersive solid-phase extraction;gas chromatography;green tea

李 寧)

TS272.7

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.05.012

2095-6002(2014)05-0063-06

陳士恒,章晴,史曉梅,等.超聲提取-分散固相萃取-氣相色譜法測定綠茶中有機磷類農(nóng)藥殘留.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報,2014,32(5):63-68. CHEN Shiheng,ZHANG Qing,SHIXiaomei,et al.Determination of13 organophosphorus pesticides residues in green tea by ultrasonic assisted extraction-dispersive solid phase extraction-gas chromatography.Journal of Food Science and Technology, 2014,32(5):63-68.

2013-09-30

中糧集團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2013-C2-F013).

陳士恒,男,工程師,博士,主要從事農(nóng)藥殘留分析方面的研究;*楊永壇,男,高級工程師,博士,主要從事色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用研究.通訊作者.