葉秀娟，鄭 炯,2,*，索化夷,2，闞建全,2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

高效液相色譜法測定永川豆豉中的6 種有機酸

葉秀娟1，鄭 炯1,2,*，索化夷1,2，闞建全1,2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

建立高效液相色譜法同時測定永川豆豉中酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸6 種有機酸含量的方法。通過色譜條件的優(yōu)化，確定永川豆豉中6 種有機酸含量測定的最佳色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.01 mol/L磷酸氫二銨（pH 2.5）和甲醇溶液，流速0.6 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長220 nm。在此條件下，上述6 種有機酸可得到很好的分離和測定。該方法各種酸的線性范圍為0.001～1.000 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999 9以上，精密度檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.07%～0.36%（n=5），重復(fù)性檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%～3.04%（n=5），回收率在94.89%～104.28%之間。該方法簡單、快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可應(yīng)用于永川豆豉中6 種有機酸的同時快速測定。

永川豆豉；高效液相色譜法；有機酸；測定

豆豉是以整粒大豆或豆瓣為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、制曲、發(fā)酵等工序加工而成的，具有極高營養(yǎng)價值和醫(yī)療價值的大豆發(fā)酵食品。豆豉歷史悠久、風(fēng)味獨特，是佐餐調(diào)味的佳品，富含大豆多肽、異黃酮、皂苷、低聚糖、溶栓酶等多種功能性成分[1]，因其具有抗氧化[2]、降壓[3]、降血糖[4]等多種保健功能而深受人們喜愛。豆豉按其發(fā)酵微生物的不同，主要可分為曲霉型、毛霉型、根霉型和細(xì)菌型，其中毛霉型豆豉以重慶的永川豆豉為代表。永川豆豉起源于300多年前[5]，外觀光亮油黑，味道清香回甜，富含人體所需的18 種氨基酸及獨特的營養(yǎng)保健功能成分。

有機酸的測定通常采用滴定法、分光光度法、氣相色譜法、薄層色譜法、酶法等[6-8]，然而各種方法都存在一定的局限性，如化學(xué)法預(yù)處理步驟較多、易受干擾，且所用時間較長；酶法每次只能測定一種有機酸；薄層色譜法只能定性和半定量，測量精度較差；氣相色譜法僅適用于測定揮發(fā)性有機酸，且需衍生處理，操作繁瑣，準(zhǔn)確度較低等。近年來，高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法因具有分離效率高、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點被越來越多地用于快速檢測領(lǐng)域。目前，國內(nèi)外有關(guān)豆豉的研究主要集中在大豆異黃酮[9-10]，豆豉的營養(yǎng)和生理功能[11-15]以及發(fā)酵微生物的分離鑒定[16-18]等方面，而有關(guān)豆豉中有機酸的研究較少[19]。有機酸是永川豆豉中主要的呈味及風(fēng)味物質(zhì)，其含量的多少與豆豉的風(fēng)味密切相關(guān)。因此，本實驗擬建立HPLC同時測定永川豆豉中酒石酸等6 種有機酸的分析方法，并對有機酸組分及含量進(jìn)行檢測，以期為永川豆豉風(fēng)味特性和發(fā)酵品質(zhì)的研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用材料為永川豆豉食品有限公司經(jīng)天然制曲發(fā)酵而成的永川毛霉型豆豉，原料大豆產(chǎn)地為吉林省。

酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、醋酸、乳酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；磷酸氫二銨、磷酸（分析純）成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純） 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（含二極管陣列檢測器）日本島津公司；ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 美國Agilent公司；Milli-Q超純水儀美國密理博公司；KQ-100B型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；Centrifuge5810高速離心機 德國Eppendorf公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：A g i l e n t Z O R B A X S B-A q（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相A為磷酸氫二銨，并用H3PO4調(diào)節(jié)pH值，流動相B為甲醇；梯度洗脫（洗脫條件：0～20 min，5%～30%B；20～25 min，30%～50%B；25～30 min，50%B；30～35 min，50%～5%B；35～45 min，5%B）；流速為0.6 mL/min；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2 樣品處理

參照楊君等[20]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取切細(xì)的2.5 g豆豉，研磨后轉(zhuǎn)入到100 mL離心管中，加入50 mL超純水，于超聲波清洗機中提取30 min，使有機酸充分浸出，冷卻后4 000 r/min離心20 min，上清液過濾到100 mL的容量瓶中，殘渣加入25 mL超純水再提取，合并上清液，用超純水定容至刻度。待測液用0.22 μm濾膜過濾，將濾液置于2 mL的進(jìn)樣瓶中待色譜測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密稱取酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸各50 mg，用超純水溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，得2.00 mg/mL的混合有機酸標(biāo)準(zhǔn)母液。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)混合母液，用超純水稀釋成1.000、0.500、0.200、0.100、0.020、0.010、0.001 mg/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至2 mL進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣，以峰面積（X）對質(zhì)量濃度（Y）求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.4 樣品測定

將處理后的樣品提取液進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量為10 μL，采用外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0、Microcal Origin 7.5等軟件進(jìn)行圖表的繪制和相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸測定色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相pH值對有機酸保留時間的影響

設(shè)置流速為0.8 mL/min、柱溫30 ℃，以0.01 mol/L磷酸氫二銨為流動相，用1.0 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH值，考察不同pH值（2.1、2.3、2.5、2.7、2.9）條件下有機酸的分離情況，如圖1所示。

圖1 流動相pH值對有機酸保留時間的影響Fig.1 Effect of mobile phase pH on the retention times of organic acids

由圖1可知，琥珀酸、檸檬酸的保留時間隨pH值的增大而呈下降趨勢，乳酸呈升高趨勢，而醋酸、蘋果酸、酒石酸則基本保持不變；pH值較低，6 種酸的峰總體分離度較好，然而出峰時間較長，隨著pH值增高，6 種酸的出峰時間總體縮短，但分離效果卻越來越差。pH值為2.1和2.3時盡管6 種酸的分離度均較好，但由于出峰時間較長加之pH值過低容易對色譜柱造成影響，故綜合考慮，當(dāng)使用pH值為2.5的0.01 mol/L磷酸氫二銨作為流動相時，6 種有機酸的分離效果較好。這一實驗結(jié)果與譚麗賢[21]采用固相萃取-HPLC法測定醬油中有機酸的最佳優(yōu)化條件基本一致。

2.1.2 流速對有機酸保留時間的影響

設(shè)定柱溫30 ℃，以0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（固定pH 2.5）為流動相，考察流速分別為0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL/min時6 種有機酸的分離情況，如圖2所示。

圖2 流速對有機酸保留時間的影響Fig.2 Effect of flow rate on the retention times of organic acids

由圖2可知，當(dāng)流速為0.5 mL/min時，6 種酸的出峰時間間距加大，有利于峰的分離，但保留時間整體靠后，導(dǎo)致分析時間延長，且各峰出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象；隨著流速的增大，分析時間明顯縮短，然而6 種酸的分離程度卻越來越差，且柱壓升高不利于色譜柱的保護(hù)與長期使用。當(dāng)流速為0.8 mL/min時，醋酸、乳酸兩者的峰形開始出現(xiàn)重疊，影響了分離效果。綜合分離效果及分析效率，最終確定0.6 mL/min的流速進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.1.3 柱溫對有機酸保留時間的影響

以0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（用1.0 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH 2.5）為流動相，固定流速0.6 mL/min不變，在25、30、35、40、45 ℃ 5 個柱溫條件下分別進(jìn)行測定，如圖3所示。

圖3 柱溫對有機酸保留時間的影響Fig.3 Effect of column temperature on the retention times of organic acids

由圖3可知，柱溫對琥珀酸及檸檬酸的影響較大；隨著柱溫的升高，各有機酸組分的出峰時間均提前，除乳酸和醋酸的分離度越來越高外，其余各種酸的分離度均越來越低。40 ℃時6 種酸的分離程度已不及35 ℃時，25 ℃時醋酸、乳酸、蘋果酸三者的分離度不高且分析時間過長，30 ℃和35 ℃條件下各種酸的分離度最好，然而考慮到溫度過高會對有機酸的揮發(fā)產(chǎn)生影響，故選擇30 ℃作為最佳的柱溫條件。江勇等[22]采用HPLC法測定醬油中的有機酸，優(yōu)化后固定柱溫為30 ℃進(jìn)行測定，與本實驗柱溫優(yōu)化結(jié)果相一致（圖4）。

圖4 有機酸混合標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of organic acid standards

2.2 線性范圍

將質(zhì)量濃度在0.001～1.0 mg/mL范圍內(nèi)的系列混標(biāo)溶液進(jìn)行HPLC分析，對各測得值進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：6 種酸的相關(guān)系數(shù)（R2）都為0.999 9，說明各種有機酸組分的峰面積和有機酸組分質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性很好，在此條件下可以很好地測定有機酸的含量。當(dāng)信噪比為3時，6 種有機酸的檢測限結(jié)果見表1。

表1 有機酸測定的線性相關(guān)性Table1 Linear equations with correlation coefficients and linear ranges, and limits of detection for six organic acids

2.3 精密度

將0.2 mg/mL的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣5 次，根據(jù)所得峰面積分別計算精密度，酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）范圍在0.07%～0.36%之間，表明該方法的精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 方法的精密度實驗（n=5）Table2 Results of precision experiments (n=5)

2.4 重復(fù)性

精密稱取同一份均勻混合的豆豉樣品5 份，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測得酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸的平均含量為4.940、9.165、13.169、8.406、10.100、18.484 mg/g，RSD分別為0.97%、0.98%、1.23%、2.66%、3.04%、1.76%，均在5%以內(nèi)，表明該方法的重復(fù)性均達(dá)到分析的要求，結(jié)果見表3。

表3 方法的重復(fù)性實驗（n=5）Table3 Results of repeatability experiments (n=5)

2.5 回收率

準(zhǔn)確稱取切細(xì)的2.0 g豆豉，按1.3.2節(jié)方法制備樣品提取液，準(zhǔn)備同一樣品提取液6 份（酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸的質(zhì)量濃度分別為0.093 4、0.183 8、0.255 6、0.157 8、0.192 4、0.364 0 mg/mL），將不同質(zhì)量濃度的各種有機酸標(biāo)樣加入至每份提取液中，充分混勻后，使得6 種有機酸添加的質(zhì)量濃度分別為0.500、0.200、0.200、0.200、0.200、0.500 mg/mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣檢測，平行測定6 次，根據(jù)加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度與檢出的質(zhì)量濃度計算回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，各種有機酸組分的回收率為94.89%～104.28%，均符合分析方法的要求。

表4 有機酸測定的回收率實驗（n=6）Table4 Recovery rates of six organic acids in spiked samples (n=6)

2.6 永川豆豉樣品的測定

在優(yōu)化的色譜條件下對永川豆豉樣品進(jìn)行測定，分析其有機酸的組成和含量。結(jié)果見表5，色譜圖見圖5。

表5 永川豆豉中各種有機酸組分含量Table5 Contents of organic acids in Yongchuan douchi

由表5可知，在建立的提取分離條件下，所測6 種有機酸中琥珀酸的含量最高，為19.061 mg/g，其次是乳酸，為13.159 mg/g，檸檬酸、蘋果酸、醋酸3 種有機酸的含量相近，分別為10.223、9.100、8.382 mg/g，酒石酸含量最低，為4.859 mg/g。這一結(jié)果表明，在本實驗建立的HPLC測定方法下永川豆豉中的主要有機酸為琥珀酸和乳酸。熊駿[19]利用紫外-分光光度法對云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸和草酸5 種有機酸的含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明乳酸的含量最高，而酒石酸含量較低，與本實驗結(jié)果具有一定的相似性。但本實驗建立的HPLC方法具有能同時測定樣品中6 種有機酸，且測定時間較短等優(yōu)點，是一種能夠應(yīng)用于豆豉中有機酸測定的快速檢測方法。

圖5 永川豆豉有機酸的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of organic acids in Yongchuan douchi

3 結(jié) 論

本實驗采用Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱，通過色譜條件的優(yōu)化，并經(jīng)過最低檢測限、精密度、重復(fù)性、回收率等方法學(xué)的考察，最終建立了一種HPLC同時測定永川豆豉中6 種有機酸的分析方法，該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確和重復(fù)性好等優(yōu)點。應(yīng)用此方法測定出永川豆豉中6 種有機酸的含量大小依次為：琥珀酸＞乳酸＞檸檬酸＞蘋果酸＞醋酸＞酒石酸。因此，HPLC同時測定永川豆豉中6 種有機酸方法的建立能夠為其他豆豉中有機酸的分析提供有益參考。

[1] 索化夷, 盧露, 吳佳敏, 等. 永川豆豉在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中基本成分及蛋白酶活性變化[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(1): 177-180.

[2] WANG Dong, WANG Lijun, ZHU Fengxue, et al. In vitro and in vivo studies on the antioxidant activities of the aqueous extracts of douchi (a traditional Chinese salt-fermented soybean food)[J]. Food Chemistry, 2008, 107(4): 1421-1428.

[3] LI Fengjuan, YIN Lijun, LU Xin, et al. Changes in angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitory activities during the ripening of douchi (a Chinese traditional soybean product) fermented by various starter cultures[J]. International Journal of Food Properties, 2010, 13(3): 512-524.

[4] CHEN Jing, CHENG Yongqiang, YAMAKI K, et al. Anti-alphaglucosidase activity of Chinese traditionally fermented soybean (douchi)[J]. Food Chemistry, 2007, 103(4): 1091-1096.

[5] 李婷婷, 索化夷, 鄭炯. 頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析永川豆豉中揮發(fā)性成分[J]. 中國調(diào)味品, 2013, 38(12): 86-90.

[6] 張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化實驗方法技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社, 1981: 115-118.

[7] 朱曉蘭, 高蕓, 蘇慶德. 毛細(xì)管氣相色譜法測定番茄中的非揮發(fā)性有機酸、高級脂肪酸和低分子量糖類[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(9): 152-157.

[8] 雷東鋒. 現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)儀器與設(shè)備[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 222.

[9] FERREIRA M P, OLIVEIRA M C N, MANDARINO J M G, et al. Changes in the isoflavone profile and in the chemical composition of tempeh during processing and refrigeration[J]. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, 2011, 46(11): 1555-1561.

[10] 索化夷, 騫宇, 盧露, 等. 永川豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的大豆異黃酮變化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(8): 270-273.

[11] REYES-BASTIDAS M, REYES-FERNANDEZ E Z, LOPEZCERVANTES J, et al. Physicochemical, nutritional and antioxidant properties of tempeh flour from common bean (Phaseolus vulgaris L.)[J]. Food Science and Technology International, 2010, 16(5): 427-434.

[12] CHANG C T, HSU C K, CHOU S T, et al. Effect of fermentation time on the antioxidant activities of tempeh prepared from fermented soybean using Rhizopus oligosporus[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2009, 44(4): 799-806.

[13] WATANABE N, FUJIMOTO K, AOKI H. Antioxidant activities of the water-soluble fraction in tempeh-like fermented soybean (GABA-tempeh)[J]. International Journal of Food Science and Nutrition, 2007, 58(8): 577-587.

[14] CUEVAS-RODRIGUEZ E O, VERDUGO-MONTOYA N M, ANGULO-BEJARANO P I, et al. Nutritional properties of tempeh flour from quality protein maize (Zea mays L.)[J]. LWT-Food Science and Technology, 2006, 39(10): 1072-1079.

[15] AZEKE M A, FRETZDORFF B, BUENING-PFAUE H, et al. Nutritional value of African yambean (Sphenostylis stenocarpa L.): improvement by solid substrate fermentation using the tempeh fungus Rhizopus oligosporus[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87(2): 297-304.

[16] CHEN Tingtao, XIONG Shunqiang, JIANG Shuying, et al. Molecular identification of microbial community in Chinese douchi during postfermentation process[J]. Food Science and Biotechnology, 2011, 20(6): 1633-1638.

[17] CHEN Tingtao, WANG Mengjuan, JIANG Shuying, et al. Investigation of the microbial changes during koji-making process of douchi by culturedependent techniques and PCR-DGGE[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2011, 46(9): 1878-1883.

[18] CHEN Tingtao, JIANG Shuying, XIONG Shunqiang, et al. Application of denaturing gradient gel electrophoresis to microbial diversity analysis in Chinese douchi[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(10): 2171-2176.

[19] 熊駿. 云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉由來乳酸菌中主要有機酸的分析及其抑菌效果研究[D]. 昆明: 昆明理工大學(xué), 2011.

[20] 楊君, 賀云川, 何家林, 等. 榨菜腌制過程中有機酸變化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(19): 182-187.

[21] 譚麗賢. 固相萃取-高效液相色譜法測定醬油中的7 種有機酸[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(7): 871-874.

[22] 江勇, 倪永年, 朱惠芳. HPLC測定醬油中的有機酸及其聚類分析[J].南昌大學(xué)學(xué)報: 理科版, 2010, 34(5): 471-475.

Determination of Six Organic Acids in Yongchuan Douchi, a Chinese Traditional Fermented Soybean Product, by HPLC

YE Xiu-juan1, ZHENG Jiong1,2,*, SUO Hua-yi1,2, KAN Jian-quan1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the simultaneous determination of organic acids in yongchuan douchi, a Chinese traditional fermented soybean product. The optimal chromatographic conditions were determined. An Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column was used to separate the organic acids. The mobile phase was a mixture of 0.01 mol/L (NH4)2HPO4(pH 2.5) and methanol solution at a flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature and UV detection wavelength were set as 30 ℃ and 220 nm, respectively. The six organic acids were successfully separated and determined under the chosen experimental conditions. The calibration curves for all these organic acids displayed a good linear relationship with correlation coefficients above 0.999 9 and precision relative standard deviations (RSDs) of 0.07%-0.36% (n = 5) and repeatability RSD of 0.97%-3.04% (n = 5). The recovery rates of the six organic acids were in the range of 94.89%-104.28%. The method is convenient, rapid, accurate, reproducible and applicable to determine organic acids in yongchuan douchi.

yongchuan douchi; high performance liquid chromatographic (HPLC); organic acid; determination

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0114-05

10.7506/spkx1002-6630-201420023

2014-01-17

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201411）

葉秀娟（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：yexiujuan127@gmail.com

*通信作者：鄭炯（1982—），男，講師，博士，研究方向為食品化學(xué)、果蔬加工。E-mail：zhengjiong_swu@126.com