李浩林，劉 箐，劉 芳，董慶利，邱 實(shí)，楊玉萍，郭慧琴，韓舜愈

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；3.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，甘肅 蘭州 730000；4.上?；墼派锟萍加邢薰荆虾?200437）

基于可視化抗體宏陣列技術(shù)的出血性大腸桿菌O157∶H7定量檢測(cè)

李浩林1,2，劉 箐2，劉 芳3，董慶利2，邱 實(shí)2，楊玉萍2，郭慧琴4，韓舜愈1,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；3.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，甘肅 蘭州 730000；4.上?；墼派锟萍加邢薰?，上海 200437）

目的：探索建立一種新的出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）的快速定量檢測(cè)技術(shù)。方法：以硝酸纖維素膜為基片，用生物芯片點(diǎn)樣儀制作抗體宏陣列，采用“雙抗夾心”原理，對(duì)出血性大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行定量檢測(cè)研究。結(jié)果：本方法對(duì)出血性大腸桿菌O157∶H7的檢出限為3.4×105CFU/mL，在105～107CFU/mL細(xì)菌濃度范圍內(nèi)，宏陣列的灰度值與細(xì)菌濃度之間有較好的線性關(guān)系。該方法可在2.5 h內(nèi)同步檢測(cè)多個(gè)樣品中出血性大腸桿菌O157∶H7的濃度。結(jié)論：通過用標(biāo)準(zhǔn)菌株、模擬帶菌等研究顯示，用宏陣列技術(shù)快速定量檢測(cè)出血性大腸桿菌O157∶H7，結(jié)果肉眼可見，穩(wěn)定準(zhǔn)確，同時(shí)操作簡便、成本低廉、無需大型設(shè)備，制作好的抗體宏陣列可用于快速評(píng)估食品中出血性大腸桿菌O157∶H7的污染狀況，尤其適合于基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速高通量樣品篩查。

出血性大腸桿菌O157∶H7；抗體宏陣列；可視化；定量檢測(cè)

出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）是一種人畜共患病病菌，該菌對(duì)酸、低溫等有較強(qiáng)的抗逆性，且致病性較強(qiáng)，可通過食品、人畜糞便等造成大規(guī)模爆發(fā)流行；該菌感染后引起嘔吐、腹瀉、發(fā)燒等癥狀，嚴(yán)重時(shí)伴有并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征、出血性腸炎等[1]。大腸桿菌O157∶H7型是引起出血性腸炎最常見的致病菌之一，1982年，美國首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7感染的疫情，是由牛肉漢堡傳播，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)是牛肉污染引起；2005年，瑞典首次暴發(fā)大腸桿菌O157∶H7疫情，由污染的萵苣引發(fā)[2]。

常見的致病菌檢測(cè)方法有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法、酶聯(lián)免疫分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[3]等，也有近幾年出現(xiàn)的生物傳感器、免疫層析、電化學(xué)免疫法、微流控芯片[4-8]等新型檢測(cè)技術(shù)，但除去傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)方法以外，以上新型方法只能進(jìn)行定性檢測(cè)，且均有操作復(fù)雜、必須配合較高級(jí)設(shè)備、檢測(cè)成本過高等問題。GB 29921—2013《食品中致病菌限量》已于2013年12月26日頒布，并于2014年7月1日實(shí)施，此會(huì)對(duì)微生物定量檢測(cè)技術(shù)提出新要求。傳統(tǒng)的定量檢測(cè)方法如平板菌落計(jì)數(shù)法，耗時(shí)費(fèi)力，無法適應(yīng)大規(guī)模篩查檢測(cè)的需要。近年來諸多學(xué)者對(duì)細(xì)菌的定量檢測(cè)進(jìn)行了研究探索，如結(jié)合實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的快速定量檢測(cè)[9-11]，但該方法在對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)中，由于受到PCR檢測(cè)模板體系較少等限制，不僅會(huì)造成較高的漏檢率，且操作相對(duì)復(fù)雜，成本較高，同時(shí)需要昂貴儀器，難以普及到基層實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)室在多年可視化蛋白芯片研究的基礎(chǔ)上，采用了可視化抗體宏陣列、酶標(biāo)抗體化學(xué)顯色等技術(shù)，研制適合新標(biāo)準(zhǔn)要求的定量檢測(cè)技術(shù)，以期為未來的致病菌定量檢測(cè)研發(fā)實(shí)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖1 可視化抗體宏陣列點(diǎn)樣設(shè)計(jì)Fig.1 Visual antibody macroarray spot design

表1 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株Table1 Standard strains used in this study

出血性大腸桿菌O157∶H7多克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體以及各標(biāo)準(zhǔn)菌株（表1） 上?；墼派锟萍加邢薰?；硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane（NC膜），孔徑0.22 μm） 美國Pall公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色液 北京天根生化科技有限公司；大腸桿菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AD6010生物芯片點(diǎn)樣儀 美國Bio-Dot公司；D90數(shù)碼相機(jī)、AF-S VR Micro-Nikkor 105mm f/2.8G IF-ED微距鏡頭 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 宏陣列制作

用含有20%甘油的碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）作為點(diǎn)樣液稀釋大腸桿菌多克隆抗體（一抗）至工作質(zhì)量濃度200 μg/mL，作為捕獲抗體，用生物芯片點(diǎn)樣儀噴點(diǎn)在1 cm2的NC膜表面，每點(diǎn)80 nL，樣點(diǎn)之間相距2 mm。點(diǎn)樣設(shè)計(jì)如圖1所示，第1行為捕獲抗體。第2行為純點(diǎn)樣液，作為陰性控制，以確保點(diǎn)樣液未受污染，避免假陽性的出現(xiàn)；第3行為羊抗豬IgG-HRP，作為陽性控制，以確保顯色液的有效性[12]。點(diǎn)樣完成后將基片置于4 ℃過夜備用。

1.3.2 宏陣列檢測(cè)

封閉：用含有3%脫脂奶粉的磷酸緩沖液洗液（phosphate buffered saline tween 20，PBST）封閉陣列基片，同時(shí)輕微振蕩；洗滌：吸除封閉液，PBST輕微振蕩洗滌3 次；免疫反應(yīng)：用菌液與抗體陣列反應(yīng)，同時(shí)輕微振蕩，之后吸除菌液，洗滌；加入二抗：將稀釋600 倍的HRP標(biāo)記大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體與宏陣列基片反應(yīng)，同時(shí)輕微振蕩，之后吸除二抗，洗滌；顯色：加入二氨基聯(lián)苯胺（diamino aniline blue，DAB）顯色液，避光顯色，同時(shí)輕微振蕩，之后吸除顯色液，并加入雙蒸水終止反應(yīng)；最后用鑷子從反應(yīng)槽中取出反應(yīng)完成的宏陣列基片，平鋪于濾紙上避光陰干。

1.3.3 陣列靈敏度實(shí)驗(yàn)

用滅菌生理鹽水依次1 0 倍梯度稀釋單菌落培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株純菌液，并倒平板計(jì)數(shù)，濃度為3.4×100～3.4×108CFU/mL，生理鹽水作為空白對(duì)照，用制作好的宏陣列基片進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合

平板計(jì)數(shù)后，用生理鹽水10 倍稀釋純菌液至3.4×107CFU/mL，再將該濃度菌液用生理鹽水依次連續(xù)對(duì)半稀釋成不同濃度的菌液作為標(biāo)準(zhǔn)液，選擇3.4×107、1.7×107、8.5×106、4.25×106、2.125×106、1.062 5×106、5.312 5×105CFU/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)菌濃度，用制作好的宏陣列基片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。之后用數(shù)碼相機(jī)拍照，此過程是在暗室中完成的，其間相機(jī)的各參數(shù)設(shè)置均保持一致，并且將相機(jī)固定在特定高度的支架之上，然后由上向下進(jìn)行拍照，以確保不同的宏陣列結(jié)果均取自于相同的光源、光強(qiáng)以及成像距離。成像過程中的相機(jī)參數(shù)設(shè)置為：感光度3 200，快門速度1/30，閃光指數(shù)17，成像距離固定的58.5 cm。最后，照片不做任何處理，用Photoshop圖像軟件在灰度模式下對(duì)照片中的檢測(cè)樣點(diǎn)進(jìn)行灰度分析，用Excel軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 模擬增菌實(shí)驗(yàn)

按照GB/T 4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗(yàn)》中的規(guī)定，對(duì)超市購買的食品面包、果凍、牛奶進(jìn)行前處理，在處理好的250 mL樣品中加入事先培養(yǎng)并且稀釋106倍的標(biāo)準(zhǔn)菌液1 mL，經(jīng)計(jì)數(shù)為380 個(gè)/mL，然后于37 ℃進(jìn)行增菌培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12、14、16 h后進(jìn)行宏陣列檢測(cè)，并同步用大腸桿菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基涂布平板計(jì)數(shù)，之后分析平板計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線推算結(jié)果的符合程度。

1.3.6 特異性檢測(cè)

用生理鹽水分別將金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等常見食源性致病菌制備成107CFU/mL菌懸液，用制作好的宏陣列進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)

本研究中所有用到的信號(hào)值，都是用軟件分析各個(gè)檢測(cè)樣點(diǎn)的單點(diǎn)灰度峰值，并換算成信號(hào)值，最終的信號(hào)值為4 個(gè)平行信號(hào)值的平均值（灰度值范圍為0～255，顏色越深，灰度值越低，本研究將所有檢測(cè)樣點(diǎn)信號(hào)值定義為：信號(hào)值=255－灰度值）。如圖2a所示，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨著菌液濃度依次降低，信號(hào)值也依次減弱，菌液濃度在3.4×104CFU/mL以下時(shí)，均不能檢出，可以看到，本抗體宏陣列的檢測(cè)靈敏度為3.4×105CFU/mL。通過軟件分析各檢測(cè)樣點(diǎn)灰度值，制作如圖2b所示直方圖，可以直觀地看到，3.4×108～3.4×105CFU/mL菌液濃度之下，其平均信號(hào)值依次為120.5、129.75、114.75、60，其中3.4×107CFU/mL菌液濃度時(shí)檢測(cè)信號(hào)值最強(qiáng)，而在3.4×108CFU/mL菌液濃度時(shí)，檢測(cè)信號(hào)值為120.5，弱于3.4×107CFU/mL菌液濃度時(shí)的信號(hào)值129.75，并且從107CFU/mL菌液濃度開始，濃度越低，檢測(cè)信號(hào)值越弱，此平均數(shù)值來自相同的3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。表2為4 個(gè)菌液濃度條件下檢測(cè)樣點(diǎn)信號(hào)值的變異系數(shù)。

圖2 靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.2 Sensitivity of the method

表2 各菌液濃度條件下信號(hào)值的變異系數(shù)Table2 Coefficient of variations of signal values for different bacterial concentrations

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

標(biāo)準(zhǔn)曲線陣列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3a所示，A、B、C為相同的3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。以檢測(cè)樣點(diǎn)平均信號(hào)值為縱坐標(biāo)，將各梯度標(biāo)準(zhǔn)菌液的濃度值以10為底取其對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，分別對(duì)應(yīng)擬合b、c、d 3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3b、c、d所示。

由圖3可見，各檢測(cè)樣點(diǎn)的信號(hào)隨著標(biāo)準(zhǔn)菌液濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，擬合的3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線也有著相似的增長趨勢(shì)，經(jīng)過對(duì)各檢測(cè)樣點(diǎn)的灰度值進(jìn)行分析，各菌液濃度條件下3 組平均信號(hào)值的變異系數(shù)如表3所示，其中，4.25×106CFU/mL菌液濃度條件下的變異系數(shù)最小，為0.37%，2.125×106CFU/mL菌液濃度條件下的變異系數(shù)最大，為1.03%，但后者仍然遠(yuǎn)小于一般酶聯(lián)免疫分析實(shí)驗(yàn)所要求的5%[13]，因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性和重復(fù)性較強(qiáng)，由此得到較為理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合實(shí)驗(yàn)Fig.3 Standard curves

表3 各菌液濃度條件下3 組平均信號(hào)值的變異系數(shù)Table3 Coefficients of variations for three average signal values

2.3 模擬增菌定量檢測(cè)

如圖4a、c、e所示，抗體陣列對(duì)果凍、面包、牛奶樣品在增菌8 h后即可檢出，但10 h之后的檢測(cè)樣點(diǎn)信號(hào)值反而隨抗原濃度的增大而降低，3個(gè)樣品在不同增菌時(shí)間的檢測(cè)平均信號(hào)強(qiáng)度如圖4b、d、f所示。

圖4 模擬增菌實(shí)驗(yàn)Fig.4 Detection of simulated enrichment culture

由圖4可見，果凍樣品在增菌8 h時(shí)檢測(cè)信號(hào)值最強(qiáng)，達(dá)到了90.25，隨后增菌10 h的檢測(cè)信號(hào)有所減弱，為85.5，而之后再增菌培養(yǎng)12、14、16 h后的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度相比于8 h和10 h進(jìn)一步減弱，但三者之間無明顯差異。如圖4d所示，面包樣品增菌8 h的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度為79.75，弱于增菌10 h的107.75，隨后的3 個(gè)增菌時(shí)間段的檢測(cè)結(jié)果依次減弱，分別為97.5、94.75和94。如圖4f所示，牛奶樣品增菌8 h的檢測(cè)強(qiáng)度為91，增菌10 h的檢測(cè)強(qiáng)度為97.75，增菌12、14、16 h的檢測(cè)強(qiáng)度依次為90、92.5、89.75，三者之間無明顯差異。

對(duì)3 個(gè)樣品增菌8 h和10 h的檢測(cè)樣點(diǎn)進(jìn)行灰度值分析，并將信號(hào)值分別代入圖3中的3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線中，推算出相應(yīng)濃度，然后與同步平板計(jì)數(shù)的結(jié)果進(jìn)行比較，如表4及圖5所示。增菌8 h和10 h的細(xì)菌數(shù)目在3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)，分析其各個(gè)檢測(cè)樣點(diǎn)的灰度值，換算成信號(hào)值并取平均值后代入圖3b、c、d 3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到相應(yīng)的推算數(shù)目，如表4所示，在同一增菌時(shí)間范圍內(nèi)，3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線推算所得到的3 個(gè)結(jié)果之間差異很小，可以忽略不計(jì)，因此可以確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)中涂布平板計(jì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線推算結(jié)果的比較Table4 Comparison of spread plate counts and results calculated from the standard curves for real samples

另外，如表4所示，對(duì)涂布平板計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線推算數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，面包樣品增菌8、10 h以及牛奶樣品增菌8 h的推算結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果在同一數(shù)量級(jí)，而果凍樣品增菌8、10 h以及牛奶樣品增菌10 h的推算結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果相差一個(gè)數(shù)量級(jí)；分析有兩部分原因，一方面，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的抗體宏陣列在實(shí)驗(yàn)過程中，各溶液、緩沖液組分單一、穩(wěn)定，對(duì)抗原抗體特異性結(jié)合影響較小，而實(shí)際樣品中成分復(fù)雜，對(duì)抗原抗體的特異性結(jié)合有較大影響，即“基質(zhì)效應(yīng)”[14]，因而在顯色完成后，標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)際樣品的信號(hào)值會(huì)有差異，從而影響推算結(jié)果；另一方面，在增菌同步涂布平板的操作過程中，不可避免的會(huì)有少量細(xì)菌殘留在涂布棒之上，從而造成平板計(jì)數(shù)的誤差；結(jié)合這兩方面原因，檢測(cè)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定程度的誤差。同時(shí)，相比于10 h增菌的檢測(cè)信號(hào)值，3 個(gè)樣品在增菌10 h之后的信號(hào)值均弱于前者，但平板計(jì)數(shù)結(jié)果卻遠(yuǎn)大于前者，這可能是因?yàn)?，抗原抗體的結(jié)合力，主要有疏水作用、愛德華力、氫鍵、離子鍵等，過量的抗體或抗原，對(duì)于二者最佳的結(jié)合比列，都有消極的影響（即抗原之間相互競爭導(dǎo)致排斥，抗原抗體結(jié)合比率下降），而隨著增菌時(shí)間的延長，細(xì)菌數(shù)目過多，即抗原的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗體的量，從而對(duì)抗原抗體的特異性結(jié)合產(chǎn)生一定程度的負(fù)面影響。最后，從表4可以看出，平板計(jì)數(shù)的結(jié)果均在增菌14 h時(shí)達(dá)到最大值，增菌16 h后細(xì)菌數(shù)目反而有所下降，說明在增菌過程中，隨著時(shí)間的延長，有限的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗殆盡，大腸菌群生長進(jìn)入衰亡期，有大量細(xì)菌死亡。

圖5 增菌過程中顯色培養(yǎng)基同步涂布平板計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.5 Spread plate counts from Escherichia coli O157∶H7 chromogenic medium

2.4 抗體宏陣列特異性實(shí)驗(yàn)

如圖6a所示，除去兩株出血性大腸桿菌O157∶H7以外，抗體宏陣列與其他細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。

圖6 大腸桿菌O157∶H7抗體陣列特異性實(shí)驗(yàn)Fig.6 Specificity of the antibody macroarray for Escherichia coli O157∶H7

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用可視化抗體宏陣列技術(shù)，探討將高通量的抗體宏陣列，運(yùn)用于單樣品多指標(biāo)食源性致病菌快速定量檢測(cè)，結(jié)果顯示：抗體宏陣列對(duì)出血性大腸桿菌O157∶H7具有很好的特異性，與其他常見食源性致病菌均無交叉反應(yīng)，模擬增菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，其檢出限為3.4×105CFU/mL，靈敏度與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）相同[15]，但耗時(shí)僅為2.5 h，并且節(jié)省抗體，操作簡便快捷，無需特殊設(shè)備，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求低，適合基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速高通量樣品篩查。

在實(shí)驗(yàn)前期，原期望采用3.4×108、3.4×107、3.4×106、3.4×105、3.4×104CFU/mL 5 個(gè)菌液濃度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的坐標(biāo)濃度，但結(jié)果顯示，相比于3.4×107CFU/mL，108菌液的檢測(cè)信號(hào)值反而弱于前者，這與模擬增菌實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的10 h之后信號(hào)值減弱的現(xiàn)象是相同原因，因此該方法對(duì)于目標(biāo)菌濃度過高的情況下，定量檢測(cè)可能與實(shí)際細(xì)菌數(shù)有較大差異；另外本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度為3.4×105CFU/mL，對(duì)104濃度菌液無法檢出，因此不能用于擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

常見的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)大都采用熒光標(biāo)記物釋放檢測(cè)信號(hào)，需要相應(yīng)熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，成本較高且結(jié)果不穩(wěn)定[16-21]，亦或是對(duì)檢測(cè)基片進(jìn)行各種修飾加工，旨在提高檢測(cè)靈敏度及特異性[22-23]，雖然有所進(jìn)步，但無形之中又增加了綜合成本，均不適合基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行前期樣品的快速高通量篩查。本實(shí)驗(yàn)研制的可視化抗體宏陣列無需信號(hào)采集系統(tǒng)，可直接用肉眼識(shí)別檢測(cè)結(jié)果，若借助常用計(jì)算機(jī)軟件，則可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

食品安全事故的頻繁發(fā)生，推動(dòng)著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，簡潔、快速、高通量已成為目前檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，基于膠體金免疫層析技術(shù)的試紙條近年來在快速檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用逐漸增多[24-25]，但要實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速篩查，則其成本較高，并且為定性檢測(cè)；抗體宏陣列檢測(cè)雖然耗時(shí)長于試紙條方法，但仍可在2.5 h之內(nèi)完成檢測(cè)，同時(shí)更適合高通量檢測(cè)。本研究隨后將嘗試在同一芯片陣列之上固定多種捕獲抗體，從而達(dá)到同步檢測(cè)多種目標(biāo)細(xì)菌的目的，同時(shí)為研制蛋白質(zhì)芯片快速檢測(cè)試劑盒做前期準(zhǔn)備。

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Quantitative Detection of Escherichia coli O157:H7 Based on Visual Antibody Macroarray Technology

LI Hao-lin1,2, LIU Qing2, LIU Fang3, DONG Qing-li2, QIU Shi2, YANG Yu-ping2, GUO Hui-qing4, HAN Shun-yu1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China; 4. Shanghai Prajan Bioiogy Technology Company, Shanghai 200437, China)

Purpose: To establish a new rapid quantitative assay for detecting Escherichia coli O157:H7. Methods: Using nitrocellulose membrane as substrate, an antibody macroarray was fabricated with a biochip spotting robot, and then a double antibody sandwich method was developed for quantitative detection of E. coli O157:H7. Results: The limit of detection (LOD) for E. coli O157:H7 was 3.4 × 105CFU/mL, and a good linear relationship was observed between grey value for the macroarray and bacterial concentration in the range of 105-107CFU/mL. This method could allow simultaneous determination of different concentrations of E. coli O157:H7 in multiple samples. Conclusions: As evaluated by applying it to standard strains and simulated enrichment culture, the antibody macroarray-based method could provide stable and accurate results visible to naked eyes with simple operation and low costs without the use of large equipment. Moreover, the antibody macroarray developed in this study could be used to rapidly assess E. coli O157:H7 pollution in food, especially suitable for rapid screening of samples in grassroots-level laboratories.

Escherichia coli O157:H7; antibody macroarray; visualization; quantitative determination

Q939.91

A

1002-6630（2014）20-0185-07

10.7506/spkx1002-6630-201420037

2013-10-21

國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（GSCIQ_2010IK220）；上海市科委重點(diǎn)支撐項(xiàng)目（13430502400）；甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（1304FKCA056）

李浩林（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：lihaolin36@sina.com

*通信作者：韓舜愈（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：lzhansy@126.com