■劉娜娜 劉長軍 李紅軍 傅玲琳 王彥波

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018；2.象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700；3.杭州天農(nóng)生物營養(yǎng)技術(shù)有限公司，浙江杭州311107）

益生菌的概念最早由Lilly和Stillwell提出，他們認(rèn)為益生菌是由一種微生物產(chǎn)生的物質(zhì)，并能夠刺激另一種微生物的生長，這種作用與抗生素恰好相反。隨后Parker（1974）將益生菌定義為能夠平衡和促進(jìn)腸道微生態(tài)的一類微生物，然而這個定義并沒有很好地與抗生素區(qū)分。Fuller（1987）又對益生菌進(jìn)行了描述，即它是一種活的微生物飼料添加劑，能夠改善腸道菌群的平衡從而對宿主動物產(chǎn)生有益影響。Kozasa首次將益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，使得益生菌更為廣泛地被推廣，其概念的外延也得到了擴(kuò)展。目前，一般認(rèn)為益生菌是一種活性微生物或微生物制劑，可以通過改善水產(chǎn)動物等宿主腸道內(nèi)微生態(tài)平衡或調(diào)節(jié)宿主黏膜與免疫系統(tǒng)功能來提高宿主的免疫力，最終有利于宿主健康。常見的水產(chǎn)動物飼料中益生菌種類主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母等。

1 水產(chǎn)動物飼料中益生菌的應(yīng)用概述

隨著水產(chǎn)動物飼料中抗生素等化學(xué)藥物的應(yīng)用帶來的負(fù)面作用日益突出，如何有效地提高水產(chǎn)動物的免疫力和對疾病的抵抗力成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和研發(fā)熱點。由于具有使用安全和方便等優(yōu)點，益生菌被逐漸應(yīng)用于魚類、甲殼類等水產(chǎn)動物飼料中，并取得了一定的成績。如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）應(yīng)用于尼羅羅非魚養(yǎng)殖中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅非魚的生長及成活率都有所提高，并且可以顯著抵抗病原菌海豚鏈球菌（Streptococcusiniae）的感染。剖析原因主要是由于嗜酸乳桿菌通過在細(xì)胞表面螯合元素鐵，使得海豚鏈球菌無法利用鐵，從而抑制了其生長繁殖。在甲殼類水產(chǎn)動物中，益生菌可以通過增強(qiáng)其免疫力來提高其成活率，如芽孢桿菌類制劑飼喂斑節(jié)對蝦后，與對照組比較成活率顯著升高，究其原因，與飼喂益生菌后斑節(jié)對蝦血淋巴吞噬作用顯著增強(qiáng)、體內(nèi)酚氧化酶和抗菌活性顯著提高，進(jìn)而增強(qiáng)蝦的細(xì)胞免疫和體液免疫競爭性排斥病原菌有關(guān)。此外，芽孢桿菌制劑飼喂凡納濱對蝦后同樣發(fā)現(xiàn)其成活率顯著升高，進(jìn)一步研究表明，成活率的顯著升高與此類芽孢桿菌改善凡納濱對蝦腸道內(nèi)微環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道中菌群的生長和平衡有關(guān)。由此可見，益生菌的作用方式并不固定，與動物種類、飼喂方式、菌種類別等均有關(guān)，從另一方面來講這就增加了相關(guān)研究的難度。

盡管益生菌在水產(chǎn)動物飼料中得到了日益廣泛的應(yīng)用，但是目前仍然有許多問題需要進(jìn)一步研究。如在定向篩選某種益生菌菌種時，要注意菌株的選育和培養(yǎng)條件對其特性的影響，這是因為即使對于同一種菌株，選育目標(biāo)和培養(yǎng)條件不同，菌株諸如胞外活性物質(zhì)的分泌能力、腸道中的穩(wěn)定定植時間等也不盡相同。研究還證實，不能單純根據(jù)益生菌在體外試驗中得到的結(jié)果來預(yù)測其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的效果。如以大西洋鮭為研究對象，體外實驗證實益生菌熒光假單胞菌具有顯著拮抗有害菌殺鮭氣單胞菌的作用，但是體內(nèi)試驗的結(jié)果卻表明，對于由殺鮭氣單胞菌引起的大西洋鮭感染病沒有效果。所以，在水產(chǎn)動物飼料中應(yīng)用的益生菌，應(yīng)該根據(jù)具體的養(yǎng)殖動物和實際使用情況來定向篩選和研發(fā)，也只有這樣益生菌才能發(fā)揮出其應(yīng)有的效果。

2 不同品種水產(chǎn)動物飼料中益生菌的應(yīng)用研究

近年來，不同品種水產(chǎn)動物（魚類、甲殼類和其他水產(chǎn)動物）飼料中益生菌的應(yīng)用研究參見表1。由表1可見，盡管益生菌菌株各異，但是絕大多數(shù)研究表明在飼料中添加和使用，均可以顯著改善水產(chǎn)動物的免疫和生長性能，提高對于病原微生物的抵抗力，降低死亡率，最終改善生產(chǎn)性能，這也是益生菌在水產(chǎn)動物飼料中應(yīng)用日益廣泛的直接原因。同時在應(yīng)用過程中也要注意益生菌的用量、穩(wěn)定性和使用方式，以及針對不同的水產(chǎn)動物研究制定包括使用最佳時間和用量等在內(nèi)的相應(yīng)配套的應(yīng)用規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，避免盲目的應(yīng)用導(dǎo)致的益生菌失效。

3 水產(chǎn)動物飼料中益生菌的作用機(jī)制

3.1 產(chǎn)生抑菌和抗菌物質(zhì)

益生菌在自身生長繁殖過程中會產(chǎn)生細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物，這類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或小肽對于產(chǎn)生菌本身沒有作用，但是可以通過其特有的方式抑制或者拮抗其他菌株，一種方式是通過結(jié)合脂質(zhì)Ⅱ（糖肽亞基在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)之間的主要載體）阻止細(xì)胞壁的合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另一種方式是脂質(zhì)Ⅱ插入到細(xì)胞膜中形成孔道，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化和三磷酸腺苷（ATP）泄露，而此時胞外的水分子進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自溶而死亡，如乳酸鏈球菌素（Nisin）就采用此類抑菌方式。此外，還有一類熱穩(wěn)定小肽類非羊毛硫細(xì)菌素，也是通過膜透化作用而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而對于大分子溶菌蛋白如葡萄球菌溶菌素（Lysostaphin），則通過作用于目標(biāo)抑制/拮抗菌的細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的溶解和最終的細(xì)胞死亡。

3.2 競爭營養(yǎng)物質(zhì)以及黏附位點

益生菌可通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，形成“優(yōu)勢菌群”，從而抑制病原菌的生長繁殖。如細(xì)菌在生長過程中需要鐵，而鐵在動物體液和組織中的量是有限的且是多以不溶解的Fe3+存在。熒光假單胞菌作為益生菌可以通過分泌鐵載體，提高對鐵的利用率進(jìn)而與病原菌鰻弧菌爭奪游離的鐵離子，最終達(dá)到抑制該菌生長的目的。益生菌通過黏附、定植在水產(chǎn)動物腸道黏膜上，并形成一層厚的菌群膜，通過這種方式與病原菌競爭黏附位點和營養(yǎng)物質(zhì)，而形成的菌群膜可以阻止病原菌的入侵，進(jìn)而達(dá)到抑制病原菌的作用。研究表明，參與與病原菌競爭黏附位點的主要是益生菌的S-層蛋白、脂磷壁酸和胞外多糖等。如乳酸菌的S-層蛋白含有大量的疏水性氨基酸，不易被水等溶劑溶解，因此有助于乳酸菌與病原菌競爭黏附位點，此外乳酸菌的胞外多糖可作為宿主配體或病原菌凝集素，對某些細(xì)菌在腸上皮細(xì)胞黏附過程中產(chǎn)生一定的屏障作用，可以導(dǎo)致病原菌因不能黏附在宿主細(xì)胞上而缺少生長空間死亡。再如脂磷壁酸是益生菌雙歧桿菌細(xì)胞外的主要疏水成分，能夠在自身表面形成一種微毛結(jié)構(gòu)，同時脂磷壁酸由于具有等電點低的特點，可使自身表面分布較多的負(fù)電荷，而雙歧桿菌與受體細(xì)胞黏附的要點就是利用這種靜電作用，因此可以與病原菌競爭黏附位點。

3.3 改善機(jī)體免疫功能

在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中，益生菌被作為飼料中免疫調(diào)節(jié)劑日益受到重視。在魚類養(yǎng)殖中，益生菌可以刺激先天性免疫和細(xì)胞免疫，包括增加紅細(xì)胞壓積，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞、溶菌酶、超氧化物歧化酶以及過氧化酶等的活性。對于蝦類養(yǎng)殖來說，益生菌可以改善蝦的肝體指數(shù)、酚氧化酶以及超氧化物歧化酶等活性，最終提高蝦的免疫力和對疾病的抵抗力。近期研究表明，益生菌免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制與動物腸道上皮細(xì)胞或某些特異腸道微生物有關(guān)。益生菌在進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)時先黏附于宿主腸道上皮細(xì)胞（IECs），然后靶向識別其表面的受體，進(jìn)而開始一系列的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號核因子κB的功能、加強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活力以及改善腸道微生態(tài)平衡。如益生菌嗜酸乳桿菌可增加結(jié)腸黏液細(xì)胞數(shù)量和黏蛋白數(shù)量，促進(jìn)黏蛋白MUC2的表達(dá)進(jìn)而穩(wěn)定腸道屏障功能；而益生菌雙歧桿菌可降低白介素（IL-6和IL-8）等促炎因子，進(jìn)而降低腸道通透性以對腸道黏膜發(fā)揮保護(hù)作用。

表1 益生菌在魚類飼料中的應(yīng)用研究

3.4 促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收

益生菌在水產(chǎn)動物體內(nèi)定植后可以產(chǎn)生消化酶，從而協(xié)同動物內(nèi)源酶共同消化和降解飼料中的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等，促進(jìn)宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，改善飼料的消化率和提高飼料利用率，最終促進(jìn)動物生長發(fā)育。此外，大部分益生菌自身含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，例如光合細(xì)菌中含有較為豐富的蛋白質(zhì)、維生素、鈣、磷和輔酶Q10等，酵母中同樣含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素，并含有消化酶和一些未知的生長刺激因子。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以通過與宿主細(xì)胞和腸道土著菌的相互作用，促進(jìn)水產(chǎn)動物自身消化酶的分泌，相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

4 水產(chǎn)動物飼料中益生菌的應(yīng)用前景

在廣泛推廣益生菌的同時，在水產(chǎn)動物飼料中應(yīng)用也面臨著現(xiàn)實的困惑，目前仍有許多研究者對益生菌菌株的安全性提出質(zhì)疑，他們認(rèn)為益生菌可能由于自身含有的一些條件性可編碼致病性、耐抗生素基因而引發(fā)安全性事件，而且一旦存在這類基因，可以通過水平轉(zhuǎn)移在菌間和菌外傳播。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和檢測手段的不斷進(jìn)步，益生菌菌株的全基因測序和分析成為了可能，隨著基因譜圖的不斷研究和后基因組時代功能基因的剖析，這一問題將會被解決。盡管相關(guān)文獻(xiàn)報道乳酸菌作為益生菌在水產(chǎn)動物飼料中是最常用的類別，但是研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的乳酸菌菌株都適合用作益生菌生產(chǎn)，需要綜合考慮菌株的特性和生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。此外，目前隨著保存時間的延長，益生菌菌株的數(shù)量或者活力均有所下降，造成了應(yīng)用效果的不穩(wěn)定，因此定向篩選技術(shù)和穩(wěn)定保存技術(shù)也需要進(jìn)一步研究，可結(jié)合分子遺傳育種學(xué)和途徑工程在菌株誘變和選育上更加突出針對性和功能性，可通過菌株理化特性和生化代謝分析，研發(fā)長期穩(wěn)定保存過程中相應(yīng)的保護(hù)劑或者保存技術(shù)。由此可見，水產(chǎn)動物飼用益生菌的研究是一個系統(tǒng)工程，需要借助于多學(xué)科的理論知識和現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展，旨在為可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供一定理論和技術(shù)支撐，實現(xiàn)水產(chǎn)品的安全生產(chǎn)。

表2 益生菌在甲殼類動物飼料中的應(yīng)用研究

表3 益生菌在其他水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用研究

（參考文獻(xiàn)43篇，刊略，需者可函索）