劉 麗，張 嬋,2,*，梁婧如，王成濤,2,*，趙吉興

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048；3.山東中惠食品有限公司，山東 惠民 251706）

CYS3基因的敲除及其對 Saccharomyces cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代謝的影響

劉 麗1，張 嬋1,2,*，梁婧如1，王成濤1,2,*，趙吉興3

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048；3.山東中惠食品有限公司，山東 惠民 251706）

研究胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3敲除對S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代謝的影響。將編碼胱硫醚-γ-裂解酶的CYS3基因和抗性標(biāo)記基因Zeocin克隆，構(gòu)建敲除組件CYS3Δ:Zeocin，醋酸鋰法將其轉(zhuǎn)化導(dǎo)入S. cerevisiae S288C表達(dá)，構(gòu)建CYS3基因敲除的工程菌。結(jié)果表明：搖瓶發(fā)酵120 h時，工程菌S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分別為0.60 g/L和0.94 g/L，S. cerevisiae C3較野生型S288C的3-甲硫基丙醇生成量降低36.2%。說明CYS3基因敲除對S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇有較大影響，并呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)作用。

釀酒酵母；胱硫醚-γ-裂解酶；基因敲除；3-甲硫基丙醇合成；負(fù)調(diào)節(jié)

3-甲硫基丙醇（又名菠蘿醇，methionol）是我國芝麻香型白酒的特征性香味物質(zhì)，也是葡萄酒、啤酒、威士忌、白蘭地、醬油、豆醬、奶酪等多種發(fā)酵食品的重要香氣組分[1-2]。3-甲硫基丙醇的香氣閾值較低，在食品中建議添加量為0.1～10 mg/kg，其風(fēng)味按濃度變化依次呈現(xiàn)出麥芽香味、香油味和熟土豆味，常用于調(diào)配菠蘿、柑橘、辣根、番茄、洋蔥、豬肉、牛肉、雞肉、巧克力、酒用香精等多種香精[1-2]。目前，3-甲硫基丙醇的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成[2-3]，盡管化學(xué)合成法成本廉價，但存在諸如原料毒性高、合成過程污染大、有毒副產(chǎn)物難于完全去除等問題。微生物轉(zhuǎn)化制備的天然香料，其構(gòu)型、手性單一，有助于香氣品質(zhì)的提高，是近年來天然香料制備的重要發(fā)展方向[3-8]。

Philippe[5]和Landaud[6]等利用13C-核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer-computer，GC-MS）研究釀酒酵母（S. cerevisiae）的突變株，初步確定了L-蛋氨酸（methionine，L-Met）生成3-甲硫基丙醇的代謝途徑和調(diào)控酶。L-蛋氨酸首先在氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成α-酮-γ-甲硫基-丁酸，然后在脫羧酶作用下脫羧生成3-甲硫基丙醛，最后在還原酶作用下還原生成3-甲硫基丙醇。L-蛋 氨酸在胱硫醚-γ-裂解酶（cystathioninegamma-lyase，EC4.4.1.1，Cys3）作用下轉(zhuǎn)化生成甲硫醇、α-酮丁酸和氨氣[9-10]，這是釀酒酵母的L-蛋氨酸分解代謝另一個途徑。Rebeille等[11]克隆了擬南芥編碼MGL的cDNA，發(fā)現(xiàn)擬南芥分解代謝蛋氨酸是去甲硫基反應(yīng)開始的。Alting等[12]研究認(rèn)為，Cys3是廣泛底物催化活性的酶，在不同生物體中參與不同代謝反應(yīng)，其作用不盡相同。NCBI數(shù)據(jù)庫資料表明，S. cerevisiae的胱硫醚-γ-裂解酶由CYS3基因編碼表達(dá)，該酶參與蛋氨酸、半胱氨酸、胱硫醚的分解代謝。Caroline等[13]研究了Oenococcus oeni的Cys3酶參與去硫基團反應(yīng)，可催化L-蛋氨酸生成甲硫醇、胱硫醚生成丙酮酸、半胱氨酸生成α-酮丁酸等，過量表達(dá)該酶基因的工程菌株，其酶活性顯著增高，相關(guān)產(chǎn)物生成量明顯增加。本實驗克隆S. cerevisiae S288C的CYS3基因，并與抗性標(biāo)記基因Zeocin連接，構(gòu)建敲除組件CYS3Δ:Zeocin，將其轉(zhuǎn)化整合到S288C基因組，構(gòu)建CYS3基因敲除的S. cerevisiae工程菌，研究探索CYS3基因敲除對L-蛋氨酸分解代謝的調(diào)控效應(yīng)及其3-甲硫基丙醇合成代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C（ATCCR26108TM）、大腸桿菌E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞天根生化科技（北京）有限公司；pPICZα A,B,C 本實驗室保存。

質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司；Prime STARTM DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 美國Promega公司；酵母提取物、胰蛋白胨 美國Oxoid公司；甲醇（色譜純） 天津市西華特種試劑廠；3-甲硫基丙醇（分析純） 美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/100 mL、酵母粉0.5 g/100 mL、氯化鈉1 g/100 mL，添加100 μg/mL氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，固體培養(yǎng)基添加1.6 g/100 mL瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/100 mL、酵母粉1 g/100 mL、葡萄糖2 g/100 mL，固體培養(yǎng)基另加1.5 g/100 mL的瓊脂粉。添加不同濃度的Zeocin用于篩選酵母轉(zhuǎn)化子。

發(fā)酵培養(yǎng)基I[14]：L-蛋氨酸 10 g/L、KH2PO41.24 g/L、K2HPO40.16 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.0，121 ℃滅菌20 min；葡萄糖20 g，溶于0.1 L蒸餾水，0.22 μm濾膜除菌；無氨基酸氮源1.7 g，溶解于0.1 L蒸餾水，0.22 μm濾膜除菌。

1.3 引物設(shè)計

本實驗所用引物序列如表1所示。

表1 實驗所用引物Table 1 The sequences of primers used in this study

1.4 PCR擴增及敲除組件CYS3Δ:Zeocin的構(gòu)建

對釀酒酵母S. cerevisiae采用酶法破壁[15]后提取其基因組，根據(jù)GenBank公布S. cerevisiae的胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3（NM-001178157）序列設(shè)計引物，以S. cerevisiae基因組為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增CYS3基因。利用表2的PCR反應(yīng)體系，總體積為50 μL，反應(yīng)程序：94 ℃、5 min，94 ℃、30s，54 ℃、40 s，72 ℃、40～80 s，34個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。利用CYS3基因序列上單一酶切位點SalI和EcoRI將Zeocin基因插入CYS3基因序列中，構(gòu)建敲除組件CYS3Δ:Zeocin，實現(xiàn)CYS3基因的敲除和Zeocin抗性基因表達(dá)。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 Components of PCR reaction system

1.5 敲除組件CYS3Δ:Zeocin的構(gòu)建與鑒定

敲除組件CYS3Δ:Zeocin的構(gòu)建策略如圖1所示。將帶有SalⅠ和EcoRI酶切位點的CYS3基因片段，37 ℃過夜雙酶切，回收；回收帶有SalⅠ和EcoRI酶切位點的Zeocin片段。上述兩回收片段經(jīng)T4 DNA Ligase 于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E. coli TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性菌落擴增繁殖進(jìn)行重組質(zhì)粒提取并測序。以測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒為模板，擴增得到敲除組件CYS3Δ:Zeocin片段，用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母。

圖1 敲除組件CCYYSS33Δ: Zeeoocciinn的構(gòu)建策略Fig.1 Building strategy of knocking out gene CYS3 CYS3Δ: Zeocin

1.6 敲除組件CYS3Δ:Zeocin轉(zhuǎn)化釀酒酵母

采用LiAc法[16]（Invitrogen公司提供）制作釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞及敲除組件的轉(zhuǎn)化，Zeocin抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗證。

1.7 陽性轉(zhuǎn)化子及野生菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

將S. cerevisiae C3、S. cerevisia e S288C分別接種到含YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min活化24 h，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中發(fā)酵。發(fā)酵18h后取適量發(fā)酵液，以后每隔24 h取1次，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測發(fā)酵液中3-甲硫基丙醇含量。

1.8 發(fā)酵產(chǎn)物3-甲硫基丙醇的檢測

于8 000 r/min離心15 min發(fā)酵培養(yǎng)液，上清液于HPLC檢測3-甲硫基丙醇[17-18]。采用LC-20A島津液相色譜儀，檢測條件：色譜柱R P-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），V（甲醇）∶V（水）= 40∶60作為流動相，檢測波長215 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min。

1.9 統(tǒng)計分析

所有實驗都進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件分析，結(jié)果以±s表示，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3的克隆

圖2 PCR擴增CCYYSS33基因 的電泳圖譜Fig.2 The electrophoretogram of PCR amplification of gene CYS3

根據(jù)GenBank報道，CYS3基因大小為1 184 bp。以S. cerevisiae S288C基因組為模 板，設(shè)計引物CYS3-F和CYS3-R，PCR擴增CYS3基因，1%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物如圖2所示，泳道1、2的1 200 bp左右有一條明顯擴增帶，其大小與文獻(xiàn)報道的一致[19]。

2.2 敲除組件中Zeocin基因序列的克隆

圖3 PCR擴增Zeeoocciinn基因的電泳圖譜Fig.3 The electrophoretogram of PCR amplification of gene Zeocin

采用引物Zeocin-F和Zeocin-R擴增Zeocin基因。圖3的Zeocin基因擴增產(chǎn)物電泳條帶大小為1 100 bp左右，與預(yù)期大小1 128 bp相符，試劑盒回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

2.3 敲除組件CYS3Δ:Zeocin 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

回收片段經(jīng)T4 DNA Ligase連接過夜，藍(lán)白斑篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，提取陽性菌落測序。以測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒為模板，以藍(lán)斑菌為陰性對照，擴增得到敲除組件CYS3Δ:Zeocin片段（圖4），并轉(zhuǎn)化導(dǎo)入S. cerevisiae S288C，Zeocin抗性篩選陽性克隆子（圖5）。分別提取陽性轉(zhuǎn)化子和野生菌基因組，并設(shè)計引物CYS3-F和CYS3-R PCR驗證，從陽性轉(zhuǎn)化子S. cerevisiae C3擴增出大小為2 100 bp左右的特異性條帶CYS3Δ:Zeocin，野生型基因組條帶大小為1 200 bp，與預(yù)期相符（圖6），說明敲除組件CYS3Δ:Zeocin已轉(zhuǎn)入S. cerevisiae S288C菌株，成功構(gòu)建了工程菌S. cerevisiae C3。

圖4 敲除組件CCYYSS33Δ: Zeeoocciinn的PCRR電泳圖譜Fig.4 The electrophoretogram of PCR amplification of CCYYSS33Δ: Zeeoocciinn

圖5 5S. cerevissiiaaee CC3陽性轉(zhuǎn)化子的篩選Fig.5 Screening of the positive transformation of S. cerevisiae C3

圖6 6S. cerevisiae CC3的PPCCRR驗證Fig.6 Validation of S. cerevisiae C3

2.4 CYS3基因敲除對S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代謝及Cys3酶活性的影響

將工程菌S. cerevisiae C3和野生型菌株S. cerevisiae S288C活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基I，搖瓶發(fā)酵，定時取樣檢測。由圖7可知，發(fā)酵24 h后，S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量趨于穩(wěn)定；發(fā)酵120 h時，S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分別為0.60、0.94 g/L，S. cerevisiae C3的目的產(chǎn)物生成量較野生型菌株降低36.2%（P＜0.01）。野生型S. cerevisiae S288C表現(xiàn)出一定的胱硫醚-γ-裂解酶（Cys3）活性，而工程菌C3未檢測到Cys3酶活性。

圖7 野生型和工程菌株的3-甲硫基丙醇產(chǎn)量比較Fig.7 Comparison of methionol yields between S. cerevisiae S288C and S. cerevisiae C3

3 討 論

微生物的L-蛋氨酸分解代謝主要由胱硫醚-γ-裂解酶、去甲硫基酶（EC4.4.1.11，methionine gamma-lyase）或其同功酶（cystathionine β-lyase，CBL）催化完成。Lee等[20]發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌在以L-蛋氨酸為底物時，過量表達(dá)去甲硫基酶的同功酶基因CBL，構(gòu)建的工程菌比野生型菌株或CBL缺失突變株產(chǎn)生更多甲硫醇。本課題組前期研究中并未檢測出S. cerevisiae S288C的去甲硫基酶活性存在，設(shè)計引物也未PCR克隆出其MGL基因，這與Philippe等[5]研究報道一致。

本實驗構(gòu)建了胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3敲除的工程菌S. cerevisiae C3，研究CYS3基因敲除對S. cerevisiae的L-蛋氨酸分解代謝途徑的影響。結(jié)果表明，敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3對S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇生物合成代謝有顯著性影響，搖瓶發(fā)酵120 h時工程菌S. cerevisiae C3的3-甲硫基丙醇產(chǎn)量較野生型S288C降低了36.2%，目的產(chǎn)物3-甲硫基丙醇產(chǎn)量有較大程度的降低，呈現(xiàn)明顯負(fù)調(diào)節(jié)作用。這一結(jié)果與國外一些相關(guān)性研究有一定差異，Knoll等[13]研究了Oenococcus oeni的胱硫醚-γ-裂解酶參與去硫基團反應(yīng)，過量表達(dá)CYS3基因的菌株，其酶活性顯著增高，L-蛋氨酸的代謝相關(guān)中間產(chǎn)物生成量明顯增加。Alting等[12]研究認(rèn)為，Cys3是廣泛底物催化活性的酶，在不同生物體中參與不同代謝反應(yīng)，其作用不盡相同，Lactococcus lactis裂解酶（β-Lyase）在干酪風(fēng)味物質(zhì)形成過程中發(fā)揮一定作用，可催化L-蛋氨酸生成甲硫醇、胱硫醚生成丙酮酸、半胱氨酸生成α-酮丁酸等。NCBI數(shù)據(jù)庫資料表明，S. cerevisiae的胱硫醚-γ-裂解酶由CYS3基因編碼表達(dá)，該酶參與蛋氨酸、半胱氨酸、胱硫醚的分解代謝。本結(jié)果是CYS3基因?qū). cerevisiae的3-甲硫基丙醇合成代謝呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)，推測CYS3基因編碼的胱硫醚-γ-裂解酶，可能同時調(diào)節(jié)多個代謝途徑，CYS3基因的敲除可能影響其他代謝途徑，導(dǎo)致釀酒酵母正常代謝失調(diào)，從而影響了3-甲硫基丙醇合成，其機理有待深入研究。

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Effects of Knockout of Gene CYS3 on Methionol Anabolism in Saccharomyces cerevisiae

LIU Li1, ZHANG Chan1,2,*, LIANG Jing-ru1, WANG Cheng-tao1,2,*, ZHAO Ji-xing3
(1. Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing 100048, China; 3. Shandong Zhonghui Food Co. Ltd., Huimin 251706, China)

This work studied effects of knockout of gene CYS3 on methionol anabolism in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). A fragment of gene CYS3 and the resistance marker gene Zeocin were cloned and a construct of knockout of gene CYS3 CYS3Δ:Zeocin was built. Using chemical lithium acetate method, the component（CYS3Δ:Zeocin）was introduced into S. cerevisiae S288C and an engineering bacterium with the knockout of gene CYS3 was obtained. The results showed that methionol yields of S. cerevisiae C3and S. cerevisiae S288C were 0.60 g/L and 0.94 g/L in shake fl ask fermentation at 120 h, respectively. Compared to that of S. cerevisiae S288C, the methionol yield of S. cerevisiae C3was decreased by 36.2%. These results suggested that knockout of gene CYS3 had a great infl uence on methionol anabolism, which appeared to play a negatively regulatory role.

S. cerevisiae; cystathioninelyase; gene knockout; methionol anabolism; negative regulatory

Q815

A

1002-6630（2014）05-0139-05

10.7506/spkx1002-6630-201405028

2013-08-17

國家自然科學(xué)基金面上項目（31071593）；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目（211101）；北京市教委科技面上項目（KM201110011001）

劉麗（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：457165343@qq.com

*通信作者：張嬋（1984—），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zhangchan@th.btbu.edu.cn

王成濤（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wct5566@163.com