楊宗照

（浙江省杭州市畜牧獸醫(yī)局,浙江杭州 310020）

PRRSV對I型IFN的調(diào)節(jié)作用研究進展

楊宗照

（浙江省杭州市畜牧獸醫(yī)局,浙江杭州 310020）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是近年來發(fā)現(xiàn)的嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種病原,在豬體內(nèi)它常以持續(xù)感染的形式存在。干擾素（IFN）特別是I型干擾素在抗病毒方面起重要作用,它的產(chǎn)生主要分為TLR等幾個途徑。論文綜述PRRSV對I型IFN的產(chǎn)生途徑的調(diào)節(jié)作用,即對TLR依賴性、RIG與MDA5依賴性、JAKSTAT等干擾素信號轉導途徑、細胞凋亡途徑的抑制和對NF-κB的上調(diào)或下調(diào)作用。

IFN；PRRSV；免疫調(diào)節(jié)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬繁殖與呼吸障礙,它在豬體內(nèi)常以持續(xù)感染的形式存在。該病毒基因組為單股正鏈RNA,全長15 kb,包含ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～7、ORF5a。其中ORF1a、ORF1b編碼2個大的多聚蛋白：pp1a、pp1a/b,它們被酶解為14個非結構蛋白（Nsp）。ORF2a、ORF2b、ORF3～7、ORF5a編碼8個結構蛋白：糖蛋白GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N、ORF5a蛋白［1］。

干擾素（IFN）是機體抵抗病毒感染的一種重要細胞因子。通過對IFN產(chǎn)生過程的調(diào)節(jié)是病毒逃避宿主抗病毒感染反應的一種途徑。

1 干擾素的分類和信號轉導途徑

IFN通常分為I、II型。I型是其中起抗病毒作用的主力,并分為許多亞型。人I型IFN分為IFN-α、IFN-β、-ω、-κ、-ε。II型干擾素只有IFN-γ。最近還發(fā)現(xiàn)了III型干擾素,IFN-λ。IFN的產(chǎn)生需要一系列的信號轉導途徑,刺激IFN的轉錄表達,最終產(chǎn)生IFN蛋白。這些途徑最初步驟需要病原等異物上的配體與宿主細胞上的受體相互識別。受體主要有Toll樣受體（TLR）、視黃酸（維甲酸）誘導基因蛋白I（RIG-I）樣受體,前者分布在一些細胞和細胞器的表面,后者分布在細胞質(zhì)中。TLR又分為13種,其中TLR3、-7、-8、-9對于控制病毒感染的作用最大,不同的受體識別不同的抗原。

I型干擾素的產(chǎn)生主要分為4條信號轉導途徑［2］：TLR3依賴性信號轉導；TLR4依賴性信號轉導；TLR7、-9依賴性信號轉導；RIG-I和MDA-5（黑色素瘤分化相關蛋白）依賴性信號轉導。這些途徑的差別主要在起始階段。

2 PRRSV對干擾素產(chǎn)生途徑的調(diào)節(jié)

PRRSV感染后以一種低病毒含量的形式持續(xù)存在,在持續(xù)感染后期,病毒復制被限制在淋巴組織和其他一些免疫器官如扁桃體、淋巴結等,也可以在公豬精子中持續(xù)存在。病毒持續(xù)存在一般與免疫反應過差有關,包括中和抗體的產(chǎn)生和先天性免疫反應。

在PRRSV感染后豬沒有典型的I型IFN反應,感染豬的IFN-α含量很低。盡管肺泡內(nèi)PRRSV復制比較活躍,但是IFN-α在感染豬的肺內(nèi)檢測不出來。IFN的抑制在MARC-145和豬肺泡巨噬細胞（PAM）上表現(xiàn)也很明顯,PRRSV抑制IFN主要是抑制了RIG-I途徑中的IPS-1（干擾素啟動子促進因子-1）［3］。

2.1 PRRSV與TLR

TLR3、TLR7對PRRSV比較重要。TLR3在腎、十二指腸、脾、肝中高度表達,而TLR7在骨髓、腸、脾、肝、肺、腸系膜淋巴結、氣管、胸腺、腎臟和皮膚中適度表達。TLR9在豬派伊爾小結中表達,單核樹突狀細胞中也可以表達。在沒有刺激的情況下,PAM細胞TLR3、TLR7、TLR8表達量比骨髓來源的未成熟樹突狀細胞（immaturedendriticcells,imDC）高。poly（I：C）刺激PAM可以促進TLR3表達,但是抑制TLR7、TLR8的表達。PRRSV在感染imDC細胞6h時下調(diào)TLR3、TLR7、TLR8,在24hpi后恢復正常［4］。有研究表明,在MARC-145上,用雙鏈RNA激發(fā)TLR3大量表達則PRRSV被抑制,相反用小干擾RNA抑制TLR3的表達增加了PRRSV的感染量,可見TLR3對于抗PRRSV感染有重要作用。

2.2 PRRSV與RIG、MDA5途徑

PRRSV可以激發(fā)NF-κB和AP-1,但是不激發(fā)IRF-3（干擾素調(diào)節(jié)因子3）,顯著阻止合成的雙鏈RNA誘導的IFN-β。進一步的試驗表明,PRRSV感染顯著滅活IPS-1（RIG-I的配體）；相比而言PRRSV感染只是部分降低了TRIF（TLR3的特異性銜接蛋白）,說明PRRSV對RIG途徑的影響很大［3］。

PRRSV的4種Nsp有抑制活力：Nsp1、Nsp2、Nsp4、Nsp11。Nsp1含有最強的抑制IFN-β啟動子的能力,其抑制機制部分上是由于它促進核內(nèi)CBP（CREB結合蛋白）的降解,抑制了IRF3與CBP的結合,這樣破壞了IFN的轉錄。

Nsp2也下調(diào)I型IFN,Nsp2是個膜錨定蛋白,含有半胱氨酸蛋白酶（CP）活力和一種解離活力, CP活力抑制了IRF3磷酸化和核移位,解離活力是它對ISG和NF-κB有作用。

Nsp11也參與了RIG-I信號抑制,與Nsp1存在于胞漿和核仁不同的是,Nsp11的表達主要在胞漿,表明它的主要功能在胞漿。Nsp11含有一個叫做NendoU結構域,有內(nèi)切酶功能。NendoU包含有2個亞基,A和B。A為功能基, B為維持Nsp11構象的基團。Nsp11阻止了IRF3和Iκ-B的磷酸化,這導致IRF3和NF-κB核轉移的抑制,從而IFN的產(chǎn)生被抑制。在Nsp11表達的細胞和PRRSV感染細胞內(nèi)IPS-1被降解了,這很可能是Nsp11對IRF3和NF-κB起作用的基礎。（圖1）。

圖1 PRRSV對IFN產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用

2.3 PRRSV與NF-κB

2.3.1 上調(diào)NF-κB

NF-κB不但在免疫方面起作用,還調(diào)節(jié)細胞增殖和生存。病毒往往阻止NF-κB的激活來逃避宿主免疫,但是有研究表明在PRRSV感染后36～48 hNF-κB會上調(diào),其作用與活病毒含量、復制相關。因為紫外線滅活不會上調(diào)此反應,PRRSV感染豬漿細胞樣樹突狀細胞后再用豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）刺激與只用TGEV刺激相比PRRSV促進了NF-κB的磷酸化。NF-κB被激活可能會有利于使病毒復制和宿主細胞增殖與凋亡的調(diào)控達到一種平衡狀態(tài)［5］。

PRRSVN蛋白可以激活NF-κB,并呈現(xiàn)劑量依賴性,N蛋白30～73處氨基酸是激活NF-κB作用功能區(qū),并分布著核定位區(qū)和核仁定位區(qū),核定位區(qū)對N形成同源二聚體也很重要,N-N二聚體可以嵌入NF-κB激活結構域中,這意味著N-N二聚體可能與NF-κB激活相關。

2.3.2 Nsp1α、Nsp2對NF-κB的下調(diào)作用

Nsp1α能夠抑制NF-κB的激活。Nsp1α可以抑制Iκ-Bα的磷酸化,阻止TNFα引起的NF-κB核轉移。Nsp1α是Nsp1的N端,含有木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（PCP酶）的結構域。Shi等［6］通過點突變證實了Zn指結構是抑制IFN-β所必需的。Nsp1α缺失C末端14個氨基酸后（這樣第2個Zn指也缺失了）,顯示不能抑制IFN,因此結果顯示Nsp1αZn指結構很可能參與NF-κB途徑的抑制。

Nsp2的卵巢腫瘤（ovariantumor,OUT）結構域能夠解離泛素或從底物中解離ISG15,因為泛素化與RIG-1和TLR信號有關,像配體蛋白的召集、Iκ-Bα的降解。Nsp2很可能通過它的OTU區(qū)抑制I型IFN的產(chǎn)生。Nsp2可以干擾磷酸化的Iκ-B多聚泛素化,引起Iκ-B降解失敗,從而下調(diào)NF-κB。

2.4 PRRSV抑制JAK-STAT和ISG途徑

PRRSV抑制I型IFN信號不只是在IFN產(chǎn)生期,而且是包括IFN分泌后。在MARC-145細胞內(nèi),在用ISG15、ISG56mRNA作為指示物顯示,感染PRRSV24h后JAK-STAT路徑被抑制, PRRSV阻止了ISGF3移到核內(nèi)。TGEV刺激pDC,發(fā)現(xiàn)STAT1的核轉移被PRRSV抑制了,起作用的是Nsp1β（不是Nsp1α）,它抑制了STAT1的磷酸化和ISGF3的核轉移。抑制ISGF3的核轉移是因為Nsp1β導致了karyopherin-α1（KPNA1）的降解［7］。ISG15是個泛素樣分子,可以可逆地與蛋白結合介導先天性抗病毒免疫。Nsp2OTU結構域有去泛素樣活力,OTU可以水解ISG15,阻止ISG15干擾素調(diào)節(jié)功能。

綜合起來,在PRRSV感染的早期,Nsp1、2、11促進病毒基因轉錄和蛋白翻譯,同時抑制I型IFN的產(chǎn)生和IFN的誘導途徑。在病毒感染后期（36～48hpi）,NF-κB路徑被激活來有利于病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)存在。

2.5 凋亡和病毒

IFN與其他細胞因子一起防御著機體,在這個過程中也伴隨著宿主細胞程序性死亡和體內(nèi)病毒量的減少。凋亡細胞在PRRSV感染豬的組織中已經(jīng)檢出,但也有研究表明凋亡細胞不感染PRRSV。有報道GP5蛋白誘導凋亡是通過作用于Bcl-2的下游起作用。凋亡功能區(qū)位于GP5蛋白N端（有119個氨基酸）。還有研究提出旁觀者細胞發(fā)生凋亡,因為根據(jù)微陣列法發(fā)現(xiàn)與對照相比PRRSV感染只是促進了極小的促凋亡基因轉錄發(fā)生。使用豬肺泡巨噬細胞和單核來源的樹突狀細胞顯示是病毒感染的時期決定了PRRSV感染細胞是走向凋亡還是抑制凋亡,感染后8h傾向于抗凋亡,但是所有的感染細胞最終凋亡和壞死而死亡。病毒蛋白的表達是誘導強烈的抗凋亡作用的必需因素。非結構蛋白可能也參與其中,因為在巨噬細胞中結構蛋白能檢出前抗凋亡效果已經(jīng)存在［8］。I型IFN產(chǎn)生和細胞凋亡都是機體對抗病毒的防御機制,并有一些共同途徑,因此PRRSV可能主動干擾凋亡,部分機制可能是由于它抑制了I型IFN的產(chǎn)生,尤其是在PRRSV感染的早期階段。

IPS-1是I型IFN誘導和細胞凋亡的共同步驟,它既能導致I型IFN表達,也能與線粒體作用,促進細胞凋亡。Nsp11能降解IPS-1mRNA,從而引起I型IFN誘導的抑制,但還不知道IPS-1降解是否也抑制細胞凋亡。SARS-CoVNsp15（PRRSV Nsp11內(nèi)切酶的同源物）,可以抑制IPS-I誘導的凋亡,推測PRRSVNsp11也可抑制凋亡。

3 小結與展望

先天免疫尤其是I型IFN信號路徑是宿主對抗病毒感染的第一道防線,PRRSV通過對IFN多個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)（包括調(diào)控TLR、IRG-I及JAKSTAT介導的I型IFN產(chǎn)生的信號路徑及凋亡）來達到利于其在宿主體內(nèi)生長的目的。N蛋白顯示激活NF-κB路徑,這與它的核定位功能、二聚體化有關。Nsp1、2、11與病毒干擾免疫調(diào)節(jié)有關,它們生物學功能的結構域或基序也有了研究。Nsp1在核內(nèi)干擾IRF3介導的IFN的產(chǎn)生,在胞漿中干擾NF-κB路徑。Nsp1亞單位Nsp1β通過在不同細胞類型中封閉不同的反應步驟抑制JAK-STAT路徑。Nsp2通過其PCP2活性封閉了IRF3的活化,抑制Iκ-B降解,通過OTU結構域減少泛素化和ISG化。Nsp11通過NendoU結構域降解IPS-1 mRNA,阻止下游IRF3和NF-κB的活化。GP5蛋白促進了細胞的凋亡。

高致病性藍耳病毒株感染豬PAM細胞中TLR3、7、8mRNA的量比普通毒株明顯升高［9］。用pDC細胞,不同的PRRSV分離株在對下調(diào)IFN的能力不同［10］。如在不同的細胞類型上,誘導IFN-β有明顯的差異。長白豬上來源的PAM與其他品種豬相比抑制或者延遲了PRRSV的生長。

PRRSV毒力與免疫調(diào)節(jié)的關系比較復雜導致控制該病比較困難,IFN活性調(diào)節(jié)位點的鑒別和使用突變的PRRSV感染性克隆來去除該病毒引起的免疫抑制功能也許是研制更加有效PRRSV疫苗的途徑之一。

［1］ DeaS,GagnonCA,MardassiH,etal.Currentknowledgeonthe structuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome（PRRS）virus：ComparisonoftheNorthAmericanandEuropean isolates［J］.ArchVirol,2000,145（4）：659-688.

［2］ 徐歆,余東游,李衛(wèi)芬.I型干擾素誘生機理的研究進展［J］.中國預防獸醫(yī)學報,2010,32（10）：824-828.

［3］ LuoR,XiaoS,JiangY,etal.Porcinereproductiveand respiratorysyndromevirus（PRRSV）suppressesinterferon-beta productionbyinterferingwiththeRIG-Isignalingpathway［J］. MolImmunol,2008,45（10）：2839-2846.

［4］ ChaungHC,ChenCW,HsiehBL,etal.Toll-LikeReceptor expressionsinporcinealveolarmacrophagesandDendriticCells inrespondingtopolyICstimulationandporcinereproductive andrespiratorysyndromevirus（PRRSV）infection［J］.Comp ImmunolMicrobiolInfectDis,2010,33（3）：197-213.

［5］ Calzada-NovaG,SchnitzleinWM,Husmann,RJ,etal. NorthAmericanporcinereproductiveandrespiratorysyndrome virusesinhibittypeIinterferonproductionbyplasmacytoid dendriticcells［J］.JVirol,2011,85（6）：2703-2713.

［6］ ShiX,ZhangX,WangF,etal.Thezinc-fingerdomainwas essentialforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus nonstructuralprotein-1αtoinhibittheproductionofinterferon-β［J］.JInterferonCytokineRes,2013,33（6）：328-334.

［7］ WangR,NanY,YuY,etal.Porcinereproductiveand respiratorysyndromevirusNsp1βinhibitsinterferon-activated JAK/STATsignaltransductionbyinducingkaryopherin-α1 degradation［J］.JVirol,2013,87（9）：5219-5228.

［8］ CostersS,LefebvreDJ,DelputtePL,etal.Porcine reproductiveandrespiratorysyndromevirusmodulatesapoptosis duringreplicationinalveolarmacrophages［J］.ArchVirol, 2008,153（8）：1453-1465.

［9］ ZhangL,LiuJ,BaiJ,etal.ComparativeexpressionofTolllikereceptorsandinflammatorycytokinesinpigsinfectedwith differentvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndrome virusisolates［J］.VirolJ,2013,10（1）：135.

［10］ BaumannA,MateuE,MurtaughMP,etal.Impactof genotype1and2ofporcinereproductiveandrespiratory syndromevirusesoninterferon-αresponsesbyplasmacytoid dendriticcells［J］.VetRes,2013,44（1）：33.

（責任編輯：盧福莊）

S852

A

0528-9017（2014）02-0281-03

文獻著錄格式：楊宗照.PRRSV對I型IFN的調(diào)節(jié)作用研究進展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學,2014（2）：281-283,287.

2013-12-18

楊宗照（1973-）,男,河南南召人,高級獸醫(yī)師,主要從事動物疫病實驗室診斷與研究工作。