姚 雯，楊天衡，劉學波

血根堿清除自由基及抑制生物大分子氧化的作用

姚 雯，楊天衡，劉學波*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

目的：評價血根堿的體外抗氧化活性，為血根堿作為天然抗氧化劑的應用提供理論依據(jù)。方法：采用DPPH自由基清除法測定血根堿的體外抗氧化能力；采用Cu2+/H2O2和AAPH體系誘導牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）氧化損傷和羰基化損傷模型，研究血根堿對上述損傷的保護作用；采用TBA法分別測定血根堿對FeSO4誘導的大豆卵磷脂氧化損傷的抑制作用，及AAPH誘導的鯡魚精DNA氧化損傷的抑制作用。結(jié)果：血根堿可有效清除DPPH自由基，且呈濃度依賴性，在100 μmol/L時清除率為85.94%；1～100 μmol/L的血根堿可顯著保護Cu2+/H2O2及AAPH體系誘導的BSA損傷；10～100 μmol/L的血根堿可顯著保護由Cu2+/H2O2體系誘導的BSA蛋白羰基化，當濃度為0.1～100 μmol/L時可顯著保護由AAPH誘導的BSA蛋白羰基化；血根堿濃度在6.25～100 μmol/L范圍內(nèi)均可顯著抑制由FeSO4及AAPH誘導的大豆卵磷脂及鯡魚精DNA的氧化損傷。結(jié)論：血根堿可有效清除自由基及保護蛋白氧化損傷和羰基化損傷，亦可顯著抑制脂質(zhì)及DNA氧化損傷。

血根堿；自由基；氧化損傷；羰基化；抗氧化

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是需氧生物體正常的代謝產(chǎn)物，在正常生理狀態(tài)下，機體可維持ROS的動態(tài)平衡，從而對細胞 及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和組織生長發(fā)育起到積極的作用。在應激情況下，生物體會產(chǎn)生過量的ROS，體內(nèi)的抗氧化劑無法與之抗衡，造成機體的氧化損傷，如蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷等[1]，進而誘發(fā)多種疾病，如阿爾茲海默癥、帕金森癥[2]、亨廷頓舞蹈癥和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等[3]。為了降低過度氧化對機體造成的損傷，一些天然抗氧化劑已受到研究者的廣泛關注，如VC、白藜蘆醇和茶多酚等[4]。血根堿（sanguinarine，SAN）屬苯菲啶型芐基異喹啉類生物堿，主要存在于罌粟科、藍堇科和蕓香科的植物中。研究表明，血根堿具有抗菌消炎、抑制多種病原菌及抗腫瘤等多種藥理作用[5]，而對于其抗氧化作用效果的研究鮮有報道。Zhong Ming等[6]報道博落回屬的8種生物堿的抗氧化活性隨著產(chǎn)地的變化各異，但對于血根堿的抗氧化活性未見分析。本實驗從血根堿對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基的清除，以及對生物大分子氧化損傷的保護來評價血根堿的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血根堿（純度≥98%）、2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH）、DPPH自由基 美國Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 西安沃爾森生物技術有限公司；鯡魚精DNA 北京百瑞金生物科技有限公司；抗脫氧核糖核蛋白抗體 （anti-DNP）、羊抗兔抗體 （goat anti-rabbit） 美國Santa Cruz公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

PowerWave XS 全波長酶標儀 美國Bio-Tek公司；65-8001垂直電泳槽、ChemiDoc XRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；AUW120D萬分之一天平 日本島津Shimadzu公司；微量移液槍 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

稱取7.80 mg的DPPH溶于100 mL甲醇溶液，配制濃度為200 μmol/L的DPPH溶液，避光保存。向離心管中分別加入500 μL DPPH甲醇溶液和500 μL血根堿稀釋梯度液，充分混合，避光靜置30 min，記為Ai；同時將等體積甲醇溶液和血根堿稀釋梯度液混合記為Aj；將等體積甲醇溶液和DPPH甲醇溶液混合記為A；甲醇溶液記為A0。在517 nm測定吸光度，每個實驗重復3 次，按式（1）計算清除率。

1.3.2 血根堿對Cu2+/H2O2及AAPH誘導 的蛋白氧化損傷的保護作用

參考喬燕[7]的方法略有改動。分別用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的BSA蛋白溶液，用蒸餾水配制濃度為10 mmol/L的CuSO4溶液，用PBS配制濃度為25 mmol/L的H2O2（注意避光保存），用蒸餾水配制濃度為500 mmol/L的AAPH溶液，37 ℃水浴下熱分解2 min備用。

向離心管中加入50 μL BSA蛋白溶液、10 μL甲醇溶液和40 μL PBS混合均勻，作為空白組；實驗組先加入50 μL BSA蛋白溶液、10 μL血根堿稀釋梯度液，混合均勻后室溫放置30 min，再分別加入CuSO4、H2O2各10 μL或20 μL AAPH，之后各加入20 μL PBS補齊反應體系；對照組將樣品梯度液換為10 μL甲醇。加樣完畢后混合均勻，在37 ℃水浴反應，Cu2+/H2O2和AAPH的反應時間分別為90 min和6 h。反應結(jié)束后加入25 μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS），95 ℃水浴5 min制備成蛋白樣品。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后，1%考馬斯亮藍R-250染色20 min[8]，脫色過夜，BSA蛋白條帶用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析。每實驗重復3次。

1.3.3 血根堿對Cu2+/H2O2及AAPH誘導的蛋白羰基化的保護作用

參考Dalle-Donne[9]和Levine[10]等的方法略有改動。將已制備好的Cu2+/H2O2及AAPH體系的蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，10 V，25 min半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將該PVDF膜與20 mmol/L的DNPH-鹽酸溶液避光衍生30 min，衍生完畢后依次以濃度為2 mol/L的HCl洗滌3 次，每次5 min，甲醇洗滌5 次，每次5 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，1×TBST洗滌3 次，每次5 min，生成的2,4-二硝基苯腙（2, 4-dinitrobenzene hydrazone，2,4-DNP）衍生物，利用抗DNP抗體4 ℃過夜孵育，次日用1×TBST洗滌后以anti-rabbit抗體孵育2.5 h，經(jīng)1×TBST洗滌后利用ChemiDoc XRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白的表達，并用Quantity one 4.6.2軟件對蛋白條帶進行定量分析。每實驗重復3 次。

1.3.4 血根堿對FeSO4誘導的脂質(zhì)過氧化的抑制作用

參照黃曉坤等[11]的方法并略加修改。用PBS配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的大豆卵磷脂，充氮氣封口，超聲30 min，制備成脂質(zhì)體。以250 μL脂質(zhì)體、40 μL的500 μmol/L FeSO4及10 μL血根堿稀釋梯度液混合記為Ai，對照組以PB代替樣品記為A0，考慮到樣品本身的顏色，將樣品本底值記為As，加樣完畢后將樣品組 和對照組避光37 ℃水浴1 h，用TBA法檢測氧化程度。即加入700 μL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）- HCl混合液（15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL濃鹽酸，依序加入100 mL雙蒸水中），100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，4 000 r/min離心10min，取上清，點入96孔板，在波長532 nm處測定吸光度。每實驗重復3 次，按式（2）計算脂質(zhì)過氧化抑制率。

1.3.5 血根堿對AAPH誘導的DNA氧化損傷的抑制作用

在AAPH熱分解產(chǎn)生的烷氧自由基攻擊下，DNA形成的裂解產(chǎn)物（活性羰基化合物）在酸性條件下與TBA反應后的產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）在532 nm波長處出現(xiàn)明顯的吸收峰[12-13]。配制質(zhì)量濃度為8 mg/mL的鯡魚精DNA及500 μmol/L的AAPH溶液。以250 μL鯡魚精DNA、10 μL血根堿稀釋梯度液及50 μL AAPH溶液混合記為Ai，對照組以PBS代替樣品記為A0，將樣品本底值記為As，加樣完畢后將樣品組和對照組避光37 ℃水浴12 h，TBA法檢測DNA氧化程度，每個實驗重復3 次，并按式（3）計算DNA氧化抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2007處理，通過SPSS 16.0軟件進行One-Way ANOVA分析，并采用Duncan’s多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血根堿對DPPH自由基的清除能力

圖1 血根堿對DPPH自由基的清除 作用Fig.1 Scavenging effect of sanguinarine on DPPH radical

由圖1可知，血根堿對DPPH自由基的清除率隨著濃度增加而顯著升高，依 次為21.45%、36.38%、58.55%、75.80%、85.94%（P＜0.05），IC50值為47.09 μmol/L，即15.65 mg/L。從實驗結(jié)果看，血根堿具有較強的清除DPPH自由基的能力，徐東艷[14]和嚴建剛[15]等報道VC清除DPPH自由基的IC50值分別為7.43 mg/L和9.1 mg/L，可見血根堿清除DPPH自由基的能力弱于VC。

2.2 血根堿對Cu2+/H2O2及AAPH誘導的蛋白氧化損傷的保護作用

Cu2+/H2O2體系產(chǎn)生的·OH及AAPH產(chǎn)生的OOH·會攻擊BSA氨基酸側(cè)鏈，造成氨基酸殘基被修飾，導致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變[16-18]。由圖2、3可知，Cu2+/H2O2和AAPH體 系均可誘導BSA發(fā)生氧化損傷，加入濃度為1、10、100 μmol/L的血根堿均可顯著保護這兩種體系誘導的BSA蛋白氧化損傷（P＜0.05），且血根堿濃度為100 μmol/L時， 對Cu2+/H2O2和AAPH誘導的BSA蛋白損傷的保護率分別達到84.17%和75.94%。

圖2 血根堿對Cu2+/H2O2誘導的蛋白氧化損傷的保護作用Fig.2 Protective effect of sanguinarine on against Cu2+/H2O2-induced BSA damage

圖3 血根堿對AAPH誘導的蛋白氧化損傷的保護作用Fig.3 Protective effect of sanguinarine on against AAPH-induced BSA damage

2.3 血根堿對 Cu2+/H2O2及AAPH誘導的蛋白羰基化的保護作用

羰基的 生成是ROS攻擊氨基酸側(cè)鏈的結(jié)果，羰基化是蛋白質(zhì)經(jīng)自由基修飾造成氧化損傷的重要標記物[16]。蛋白質(zhì)羰基化也是評價蛋白質(zhì)總氧化水平 的常用方法。Cu2+/H2O2和AAPH體系均可顯著誘導BSA發(fā)生羰基化，由圖4可知，加 入0.1、1 μmol/L血根堿趨于降低Cu2+/H2O2體系誘導的BSA羰基化程度（P＞0.05），當血根堿濃度為10、100 μmol/L時可顯著降低Cu2+/H2O2體系誘導的BSA蛋白羰基化程度（P＜0.05），并使BSA蛋白羰基化程度恢復至空白組水平（P＞0.05）。

圖4 血根堿C對u2+/H2O2誘導的蛋白羰基化的保護作用Fig.4 Inhibitory effect of sangui narine on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation

圖5 血根堿對AAPH誘導的蛋白羰基化的保護作用Fig.5 Inhibitory effect of sanguinarine on AAPH-induced prote in carbonylation

由圖5可知，加入0.1、1、10、100 μmol/L血根堿均可顯著保護由AAPH誘導的BSA蛋白羰基化（P＜0.05），但100 μmol/L血根堿組對AAPH誘導的BSA蛋白羰基化仍未恢復至空白組水平（P＜0.05）。本實驗表明，與Cu2+/H2O2體系相比，AAPH誘導的BSA蛋白羰基化程度較高。

2.4 血根堿對FeSO4誘導的脂質(zhì)過氧化的抑制作用

圖6 血根堿eS對O4誘導的脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.6 Effect of sanguinarine on FeSO4-induced soy lecithin peroxidation

卵磷脂中的多不飽和脂肪酸在金屬離子催化下形成的烷過氧自由基（ROO·）與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物作用，發(fā)生生物膜的脂質(zhì)過氧化，導致膜損傷與組織損傷[19-20]。由圖6可知，隨著血根堿濃度的增加，脂質(zhì)過氧化的抑制率也有一定程度的提高，加入6.25、12.5、25 μmol/L的血根堿趨于增加脂質(zhì)過氧化的抑制率（P＞0.05），當血根堿濃度為50、100 μmol/L時可顯著提高其抑制率（P＜0.05）。

2.5 血根堿對AAPH誘導的DNA氧化損傷的抑制作用

圖7 血根堿對AAPH誘導的DNA氧化損傷的抑制作用Fig.7 Inhibitory effects of sanguinarine on to AAPH-initiated oxidative DNA damage

DNA攜帶機體的重要遺傳信息，氧化修飾不但會造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的改變，甚至會造成基因突變等[21]。由圖7可知，隨著血根堿濃度的增加，DNA氧化損傷的抑制率逐步提高，不同濃度的血根堿均可顯著抑制AAPH誘導的DNA氧化損傷（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

3 結(jié) 論

本實驗表明，血根堿可有效清除DPPH自由基，且呈濃度依賴性，并保護Cu2+/H2O2、AAPH誘導的BSA蛋白氧化及羰基化損傷，亦可顯著抑制CuSO4誘導的脂質(zhì)過氧化及AAPH誘導的DNA氧化損傷，可見，血根堿可有效保護生物大分子的氧化和羰基化損傷，具有作為天然抗氧化劑的潛力。

[1] CIRCU M L, AW T Y. Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2010, 48(6): 749-762.

[2] JOMOVA K, VONDRAKOVA D, LAWSON M, et al. Metals, oxidative stress and neurodegenerative disorders[J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2010, 345(1/2): 91-104.

[3] MARTíNEZ A, PORTERO OTIN M, PAMPLONA R, et al. Protein targets of oxidative damage in human neurodegenerative diseases with abnormal protein aggregates[J]. Brain Pathology, 2010, 20(2): 281-297.

[4] 趙保路. 自由基, 營養(yǎng), 天然抗氧化劑與衰老[J]. 生物物理學報, 2010, 26(1): 26-36.

[5] DVORAK Z, SIMANEK V. Metabolism of sanguinarine: the facts and the myths[J]. Current Drug Metabolism, 2007, 8(2): 173-176.

[6] ZHONG Ming, HUANG Kelong, ZENG Jianguo, et al. Determinationof contents of eight alkaloids in fruits of Macleaya cordata (Willd) R. Br. from different habitats and antioxidant activities of extracts[J]. Journal of Central South University of Technology, 2010, 17: 472-479.

[7] 喬燕, 劉學波. 草質(zhì)素體外清除自由基及抑制蛋白質(zhì)氧化的作用[J].食品科學, 2013, 34(17): 106-110.

[8] MAYO J C, TAN D X, SAINZ R M, et al. Protection against oxidative protein damage induced by metal-catalyzed reaction or alkylperoxyl radicals: comparative effects of melatonin and other antioxidants[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 2003, 1620(1): 139-150.

[9] DALLE-DONNE I, ROSSI R, GIUSTARINI D, et al. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress[J]. Clinica Chimica Acta, 2003, 329(1): 23-38.

[10] LEVINE R L, GARLAND D, OLIVER C N, et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins[J]. Methods in Enzymology, 1990, 186: 464.

[11] 黃曉昆, 黃曉冬, 卞美君. 南方堿蓬葉黃酮類化合物含量及其體外抗氧化活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(3): 389-400.

[12] AESCHBACH R, L?LIGER J, SCOTT B C, et al. Antioxidant actions o f thymol, carvacrol, 6-gingerol, zingerone and hydroxytyrosol[J]. Food and Chemical Toxicology, 1994, 32(1): 31-36.

[13] ZHAO Feng, LIU Zaiqun, WU Di. Antioxidative effect of melatonin on DNA and erythrocytes against free-radical-induced oxidation[J]. Chemistry and Physics of Lipids, 2008, 151(2): 77-84.

[14] 徐冬艷, 劉斌, 王偉. 基于抗氧化效應的降脂寧質(zhì)量評價方法研究[J].中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(10): 44-47.

[15] 嚴建剛, 張名位, 楊公明, 等. 芹菜黃酮的提取條件及其抗氧化活性研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報: 自然科學版, 2005, 33(1): 131-135.

[16] 李國林, 印大中. ROS介導的蛋白質(zhì)氧化的生化機制[J]. 生命的化學, 2007, 27(6): 516-520.

[17] 李冰冰, 趙倩, 張龍富. 活性氧與蛋白質(zhì)氧化損傷[J]. 平頂山工學院學報, 2005, 14(5): 16-17.

[18] 郁軍超, 薛連璧. 機體ROS的產(chǎn)生及對生物大分子的毒性作用[J].山東醫(yī)藥, 2012, 52(8): 94-102.

[19] TAMPO Y. Studies on membrane factors in iron-supported lipid peroxidation[J]. Yakugaku Zasshi: Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 2000, 120(4): 387.

[20] 梁俊, 李建科, 趙偉, 等. 石榴皮多酚體外抗脂質(zhì)過氧化作用研究[J].食品與生物技術學報, 2012, 31(2): 159-165.

[21] 張德莉, 朱圣姬, 羅光富, 等. 自由基與DNA氧化損傷的研究進展[J].三峽大學學報: 自然科學版, 2004, 26(6): 563-567.

Sanguinarine Scavenges Free Radicals and Protects against Oxidative Damage of Biological Macromolecules

YAO Wen, YANG Tian-heng, LIU Xue-bo*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The purpose of this paper is to evaluate the in vitro antioxidant activity of sanguinarine (SAN). The 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of SAN was measured, and the protective effect against oxidative damage and carbohylation of bovine serum albumin (BSA) induced in Cu2+/H2O2and 2,2-azobis(2-amidinopropane dihydrochloride) (AAPH) system was examined. The 2-thio-barbituric acid (TBA) method was applied to determine the protective effect of SAN against FeSO4-induced oxidative damage of soy lecithin and AAPH-induced oxidative damage of herring sperm DNA. The results showed that SAN effectively removed DPPH free radicals in a dose-dependent manner, with a clearance rate of 85.94% at a concentration of 100 μmol/L. Adding 1 to 100 μmol/L SAN could signifi cantly protect BSA against oxidative damage induced by Cu2+/H2O2and AAPH system, and adding 10 to 100 μmol/L and 0.1 to 100 μmol/L SAN could signifi cantly protect BSA against carbonylation damage induced by Cu2+/H2O2and AAPH system, respectively. SAN signifi cantly protected soy lecithin against FeSO4-induced oxidative damage and protect herring sperm DNA against AAPH-induced oxidative damage in the range of 6.25–100 μmol/L. In conclusion, SAN can effectively scavenge free radicals, inhibit oxidative protein damage and carbonylation, and suppress lipid and DNA oxidative damage.

sanguinarine; free radical; oxidative damage; carbonylation; antioxidant activity

TS201.4

A

1002-6630（2014）09-0137-05

10.7506/spkx1002-6630-201409028

2013-11-30

姚雯（1989—），女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與功能食品因子。E-mail：wendy0120@me.com

*通信作者：劉學波（1975—），男，教授，博士，研究方向為營養(yǎng)與功能食品因子。E-mail：xueboliu@nwsuaf.edu.cn