王 健，黃午陽，李春陽，鄭其升，劉婭梅

氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎癥的抑制作用

王 健1,2，黃午陽1,*，李春陽1，鄭其升3，劉婭梅3

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014）

目的：研究氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對細胞腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human vascular umbilical endothelial cells，HUVEC）所產(chǎn)生炎癥的抑制作用。方法：設(shè)立分組，空白組（二甲基亞砜）、10 μg/L TNF-α刺激組、濃度為1、10、50、100 μmol/L氯化錦葵色素-3-半乳糖苷＋10 μg/L TNF-α刺激組，通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法檢測細胞上清中可溶性細胞間黏附因子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）蛋白含量的變化；用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測細胞中ICAM-1 mRNA表達量變化；Western blotting檢測ICAM-1及核因子κB抑制蛋白（IκBα）蛋白含量的變化；通過免疫熒光方法測定核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）核異位的變化。結(jié)果：氯化錦葵色素-3-半乳糖苷呈濃度依賴性的抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVEC相應(yīng)蛋白表達，同時結(jié)果顯示抑制作用與NF-κB信號通路有關(guān)。結(jié)論：氯化錦葵色素-3-半乳糖苷抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVEC的炎癥反應(yīng)。一般心血管疾病產(chǎn)生的原因中包括因促炎癥因子引起的內(nèi)皮功能障礙及產(chǎn)生的炎癥，氯化錦葵色素-3-半乳糖苷的抗炎癥作用為防治心血管疾病提供了一定的理論基礎(chǔ)。

氯化錦葵色素-3-半乳糖苷；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；腫瘤壞死因子；炎癥反應(yīng)；細胞間黏附因子；核轉(zhuǎn)錄因子

細胞炎癥引起的內(nèi)皮細胞損傷可以促使白細胞及單核細胞聚集，繼而黏附于血管內(nèi)壁引發(fā)血管功能障礙[1]。細胞間黏附因子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）主要表達于活化的T細胞、血管內(nèi)皮細胞等表面，在正常情況下很少表達或不表達，當(dāng)受到細胞因子刺激時表達明顯增加[2]。促炎癥細胞因子（TNF-α、IL-6、Ang-Ⅱ）可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達相應(yīng)蛋白，能顯著增強血管內(nèi)皮細胞ICAM-1蛋白和mRNA的表達，促進炎癥發(fā)生及發(fā)展進程[3-4]。

抗氧化物質(zhì)對氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮系統(tǒng)損傷具有防治作用[5-6]。花青素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性抗氧化劑。藍莓作為功能性食品，其果實中花青素含量很高而且種類豐富，具有抗炎癥、增強心臟功能、改善循環(huán)、防止腦神經(jīng)衰老、明目及抗癌等獨特功效[7]。研究也發(fā)現(xiàn)抗氧化物質(zhì)花青素中重要組分如錦葵色素-3-葡萄糖苷及白藜蘆醇具有抗動脈粥樣硬化作用[8-9]。

對于藍莓花青素的提取分離及抗氧化能力方面研究甚多，但在分子基礎(chǔ)研究藍莓花青素抗炎癥的很少，而野生種藍莓中各花青素中錦葵色素的含量最高[10]。本研究以氯化錦葵色素-3-半乳糖苷為對象，研究其在內(nèi)皮細胞內(nèi)抑制炎癥因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3～6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞 江蘇省農(nóng)科院國藥中心保存；氯化錦葵色素-3-半乳糖苷 美國Sigma公司；ICAM-1 ELISA試劑盒、兔抗人ICAM-1一抗、鼠抗人β-actin一抗、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 博士德公司；兔抗人IκBα一抗、NF-κB核轉(zhuǎn)運試劑盒 碧云天公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YDS-10B液氮罐 四川西亞低溫設(shè)備有限公司；Airtech超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5% CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；Axiovert-40C倒置顯微鏡、熒光顯微鏡 德國蔡司公司；TDZ4-W5小型離心機 上海啟湘儀器有限公司； BG25金屬浴 明基公司；Western blotting電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY-300C轉(zhuǎn)膜儀 北京君意儀器公司；酶標儀Awareness技術(shù)公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；PCR儀 日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)、傳代[11]

復(fù)蘇液氮凍存的3～6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞，37℃融化，1 000 r/min離心3 min，吹打細胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)待細胞長至80%～90%，進行傳代。

1.3.2 樣品制備

取1.891 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解1 mg的氯化錦葵色素-3-半乳糖苷制備成1 μmol/mL的原液，根據(jù)要求分別稀釋到最終濃度為1、10、50、100 μmol/L。

細胞進行6 孔板培養(yǎng)，設(shè)立分組：空白組 （DMSO）、TNF-α （10 μg/L）刺激組、濃度為1、10、50、100 μmol/L氯化錦葵色素-3-半乳糖苷（malvidin-3-galactoside chloride，Mv-3-gal-Cl）＋10 μg/L TNF-α刺激組，預(yù)先加入不同質(zhì)量濃度的氯化錦葵色素-3-半乳糖苷刺激18 h，再加入10 μg/L TNF-α刺激6 h。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法測定細胞上清可溶性ICAM-1蛋白含量[12]

細胞經(jīng)不同分組藥物刺激，取細胞上清，按一定比例稀釋，根據(jù)ELISA試劑盒進行操作，在酶標儀450 nm波長處測定OD值。

1.3.4 Western blotting測定細胞中ICAM-1及IκBα蛋白含量[13]

棄6 孔板培養(yǎng)液，裂解細胞得到蛋白樣品，12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行電泳。PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)1.5 h，取膜37 ℃封閉、孵育一抗各1 h，TBST洗5 次，每次6 min， 37℃孵育二抗1 h，TBST洗滌，DAB顯色，拍照分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 實時熒光定量PCR測定細胞中ICAM-1 mRNA含量

在GenBank查詢到目的基因β-actin、ICAM-1的mRNA序列，根據(jù)引物原則設(shè)計引物。β-actin：正向引物5’-CCACAGTCACCT-ATGGCAAC-3’和反向引物5’-AGTGTCTCCT GGCTCTGGTT-3’；ICAM-1：正向引物5’-CCACAGTCACCT-ATGGCAAC-3’和反向引物5’-AGTGTCTCCT GGCTCTGGTT-3’。棄6孔板培養(yǎng)基進行細胞總RNA提取[14-15]，根據(jù)PrimeScript RT Master Mix配制反應(yīng)體系，37 ℃，15 min，85 ℃，5 s；繼而PCR反應(yīng)，根據(jù)瓊脂糖電泳檢驗cDNA及引物質(zhì)量；根據(jù)SYBR Real Time PCR 反應(yīng)試劑盒配制PCR反應(yīng)液，用所有的測試樣本和校準樣本，采用2-’Ct計算細胞中ICAM-1 mRNA表達水平比率。

1.3.6 免疫熒光法檢測NF-κB核轉(zhuǎn)運變化[16]

將細胞懸浮液鋪96孔細胞板，設(shè)立分組與重復(fù)，待細胞長至90%時棄培養(yǎng)液，根據(jù)碧云天NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒進行操作，在熒光顯微鏡下觀察NF-κB（p65）紅色熒光和細胞核藍色熒光亮度變化。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有變量以x±s表示。多組均數(shù)間采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用Dunnett-t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對細胞表達ICAM-1蛋白的影響

表1 不同濃度Mv-3-gal-Cl對TNF--α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ICAM--1蛋白表達的影響（x±s，n=3）Table 1 Effect of Mv-3-gal-Cl on TNF-α-induced ICAM-1 protein expression in HUVECss (x±s, n=3)

圖1 不同濃度Mv-3-gal-Cl對TNF--α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中ICAM-1表達的影響Fig.1 Effect of Mv-3-gal-Cl at various concentrations on TNF-αinduced ICAM-1 protein expression in HUVECs

由表1和圖1可知，通過ELISA及Western blotting方法檢測不同濃度Mv-3-gal-Cl對細胞上清和細胞中ICAM-1蛋白水平的表達影響時發(fā)現(xiàn)，正常HUVEC細胞在未激活的狀態(tài)下只有少量ICAM-1蛋白表達，在受到TNF-α誘導(dǎo)刺激下，ICAM-1表達顯著增加。在細胞孵育不同濃度Mv-3-gal-Cl與TNF-α后，ICAM-1的表達明顯下降，并呈濃度依賴性。濃度為1～50 μmol/L時，細胞上清中ICAM-1可溶性蛋白抑制效果明顯（P＜0.01）；濃度為100 μmol/L時，抑制效果差異性很顯著（P＜0.001）。在濃度為10、50、100 μmol/L時，細胞中ICAM-1蛋白水平比較降低明顯，抑制率分別為45.38%、54.61%、93.84%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對細胞表達ICAM-1 mRNA的影響

為了檢測Mv-3-gal-Cl如何在mRNA水平上抑制細胞表達ICAM-1，即采用實時熒光定量PCR檢測細胞中ICAM-1 mRNA表達量的變化，用內(nèi)參歸一法確定相對表達量，由圖2可知，單獨TNF-α刺激細胞時ICAM-1 mRNA的表達量明顯增加；同時孵育不同濃度的Mv-3-gal-Cl和TNF-α?xí)r，ICAM-1的相對mRNA的表達量隨濃度的增加而降低。在濃度為1 μmol/L時，細胞中ICAM-1 mRNA表達量相對較低（P＜0.05）；在濃度為10、50、100 μmol/L時，細胞中ICAM-1 mRNA表達量相對單獨TNF-α刺激組的抑制率為79.96%、87.94%、106.26%，具有明顯顯著性差異（P＜0.01），從而對細胞具有一定的保護作用。

圖2 不同濃度Mv-3-gal-Cl對TNF--α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中ICAM-1 mRNA 表達的影響Fig.2 Effect of Mv-3-gal-Cl at various concentrations on TNF-αinduced ICAM-1 mRNA expression in HUVECs

2.3 氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對細胞IκBα表達的影響

圖3 不同濃度Mv-3-gal-Cl對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中IIκBα表達的影響Fig.3 Effect of Mv-3-gal-Cl at various concentrations on TNF-αinduced IκBα expression in HUVECs

圖4 不同濃度Mv-3-gal-Cl對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中IIκBα表達的影響Fig.4 Effect of Mv-3-gal-Cl at various concentrations on TNF-αinduced IκBα expression in HUVECs

采用Western blotting檢測細胞質(zhì)中IκBα蛋白表達量的變化，由圖3、4可知，正常細胞未受到刺激時IκBα未被酸化，含量很高。在受到TNF-α刺激時，細胞質(zhì)中IκBα相對含量明顯降低，IκBα被降解。當(dāng)不同濃度的Mv-3-gal-Cl和TNF-α同時作用時，Mv-3-gal-Cl明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞中IκBα的泛酸化降解，并且呈濃度依賴性。在濃度為1 μmol/L時，細胞中IκBα相對含量低（P＜0.05）；在濃度為10、50、100 μmol/L相比單獨TNF-α刺激組具有顯著性意義（P＜0.01）。

2.4 氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對細胞核NF-κB表達的影響

圖5 不同濃度的Mv-3-gal-Cl對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中NNFF--κB核異位的變化Fig.5 Effect of Mv-3-gal-Cl at various concentration on TNF-αinduced NF-κB nuclear translocation in HUVECs

由圖5可知，通過免疫熒光法檢測NF-κB轉(zhuǎn)入核內(nèi)情況發(fā)現(xiàn)，細胞未受刺激時核內(nèi)NF-κB的含量很低，熒光強度很弱。在單獨受到TNF-α刺激時，NF-κB被激活，大量的轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，捕捉的熒光強度變強。不同濃度Mv-3-gal-Cl和TNF-α同時作用下Mv-3-gal-Cl抑制了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，阻止其進入核內(nèi)進而轉(zhuǎn)錄翻譯各種相應(yīng)蛋白，因而熒光強度漸漸變?nèi)?，抑制作用呈濃度依賴性。濃度?00 μmol/L時，熒光強度接近于正常組，具有顯著意義。

3 結(jié)論與討論

眾所周知，細胞因子網(wǎng)絡(luò)不僅參與維護正常血管的功能，而且參與涉及血管的各種病理過程。近年研究表明，心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展是細胞通過分泌生長因子、趨化因子及其他細胞因子而相互調(diào)控的結(jié)果。ICAM-1在靜息的白細胞、內(nèi)皮細胞呈低水平表達，維持正常的細胞生理作用[17]。然而當(dāng)細胞受到外界炎癥因子TNF-α、IL-6、IFN-γ的刺激作用下，ICAM-1在纖維細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞等表達迅速上調(diào)，影響細胞活力及正常功能[18-19]。大量的研究證實氧化應(yīng)激亦可引起血管內(nèi)皮功能障礙，而抗氧化物質(zhì)對細胞具有保護作用，可抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究從分子機理上研究抗氧化物藍莓花青素氯化錦葵色素-3-半乳糖苷的抗炎癥作用機理，結(jié)果顯示氯化錦葵色素-3-半乳糖苷通過抑制NF-κB信號通路的激活減少TNF-α誘導(dǎo)的炎癥因子ICAM-1蛋白和mRNA的過表達，并且抑制活性呈濃度依賴性。

TNF-α刺激內(nèi)皮細胞表達ICAM-1蛋白主要是通過激活NF-κB信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)[21]；本研究通過Western blotting檢測細胞質(zhì)中IκBα蛋白得出，正常細胞中IκBα相對含量比較高，當(dāng)受到TNF-α介導(dǎo)時，IκBα蛋白含量降低，驗證了IκBα被磷酸化，隨即被泛酸連接酶識別而被降解[22]；而當(dāng)孵育不同濃度氯化錦葵色素-3-半乳糖苷時，IκBα相對表達量相比刺激組呈濃度依賴性，具有顯著性抑制作用。此外，通過免疫熒光檢測NF-κB核轉(zhuǎn)運情況也得到相應(yīng)結(jié)果，單獨TNF-α組捕捉的NF-κB熒光強度最強，NF-κB是與它的抑制性亞基IκB分開并進人核內(nèi)激活靶基因轉(zhuǎn)錄[23]；隨著不同濃度的氯化錦葵色素-3-半乳糖苷的刺激，NF-κB熒光強度相對于對照組漸漸變?nèi)?，證實了氯化錦葵色素-3-半乳糖苷能阻止NF-κB的激活進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯。

總之，氯化錦葵色素-3-半乳糖苷作為花青素中的重要組成部分及營養(yǎng)物質(zhì)，通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)途徑抑制黏附因子ICAM-1在蛋白及mRNA水平上的表達，從而對TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎癥具有一定抑制作用，防止內(nèi)皮細胞損傷及紊亂，具有抗炎癥作用。由于一般心血管疾病產(chǎn)生的原因中包括因為促炎癥因子引起的內(nèi)皮功能障礙及產(chǎn)生的炎癥，氯化錦葵色素-3-半乳糖苷的抗炎癥作用為防治心血管疾病提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Inhibitory Effect of Malvidin-3-Galactoside Chloride on TNF-α-Induced Inflammation in Endothelial Cells

WANG Jian1,2, HUANG Wu-yang1,*, LI Chun-yang1, ZHENG Qi-sheng3, LIU Ya-mei3

(1. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Science, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. National Technical Research Centre of Veterinary Biological Products, Jiangsu Academy of Agricultural Science, Nanjing 210014, China)

Objective: The effect of malvidin-3-galactoside chloride (Mv-3-gal-Cl) on TNF-α-induced inflammation in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was investigated in this study. Methods: HUVEC were treated with TNF-α (10 μg/L) alone and combined with Mv-3-gal-Cl (1, 10, 50 and 100 μmol/L), respectively. DMSO was used as control. The soluble ICAM-1 protein content in cell supernatant wa s detected by ELISA. The change in ICAM-1 mRNA expression level in cells was detected by RT-PCR. The expression of ICAM-1 and IкBα was assessed by Western blotting. The activity of NF-кB was evaluated by immunofluorescence. Results: Mv-3-gal-Cl appeared to specifically down-regulate the TNF-α-induced cell surface expression of ICAM-1 and ICAM-1 mRNA expression and protein release from HUVEC cells in a concentration-dependent manner. The inhibitory effect of Mv-3-gal-Cl on protein expression might be associated with the suppression of NF-κB in HUVECs. Conclusion: Mv-3-gal-Cl can inhibit TNF-α-induced inflammation in HUVECs. The anti-inflammatory effect of Mv-3-gal-Cl provides a theoretical basis for preventing and treating pro-inflammatory cytokinesinduced endothelial dysfunction and cardiovascular diseases resulting from inflammation.

malvidin-3-galactoside chloride (Mv-3-gal-Cl); human umbilical vein endothelial cell (HUVEC); tumor necrosis factor-α; inflammatory effect; intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1); NF-kappa B

R329.25；R332

A

1002-6630（2014）09-0241-05

10.7506/spkx1002-6630-201409047

2013-06-09

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（NSFC31101264）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（RK2011677）；

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項目（cx（12）5029）

王健（1988—），女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與功能食品。E-mail：wangjian454348952@126.com

*通信作者：黃午陽（1979—），女，副研究員，博士，研究方向為營養(yǎng)與功能食品。E-mail：wuyanghuang@hotmail.com