劉亞偉，耿果霞，李青旺＊，江中良，王立強(qiáng)

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

目前，豬的人工授精通常使用冷凍保存和液態(tài)保存的精液，在冷凍保存過程中，由于用于豬精液對溫度變化極度敏感，導(dǎo)致冷凍保存后的豬精子活率低，受胎率和產(chǎn)仔數(shù)都比較低，所以液態(tài)保存仍然是用于人工授精豬精液的主要儲(chǔ)存方法［1］。豬精液儲(chǔ)存過程發(fā)生的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致精液品質(zhì)的下降，進(jìn)而影響精子的受精能力［2］。在豬精液儲(chǔ)存方面，主要通過在豬精液稀釋液中添加抗氧化劑和糖類，以此延長豬精液低溫保存時(shí)間。Kaeoket等［3］對半胱氨酸、谷胱甘肽和水溶性維生素P對豬精液冷凍保存的效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了這些抗氧化劑對豬精液冷凍保存的較好的作用。Funahashi和Sano［4］對谷胱甘肽、半胱氨酸和亞?；撬釋ondena稀釋液的精液常溫儲(chǔ)存效果進(jìn)行了研究，同樣作者也發(fā)現(xiàn)了這些抗氧化劑對精液儲(chǔ)存的有益作用。另外，Malo等［5］對豬精液的冷凍液中加入乳糖、紅景天多糖和葡萄糖，對這些糖對豬精液冷凍儲(chǔ)存的效果進(jìn)行了研究。但從當(dāng)前應(yīng)用的豬精液稀釋液來看，精液低溫保存時(shí)間通常在4～6d，還不能滿足一些偏遠(yuǎn)地區(qū)的養(yǎng)豬生產(chǎn)，因此，開發(fā)一種長效的低溫稀釋液對促進(jìn)偏遠(yuǎn)地區(qū)的養(yǎng)豬生產(chǎn)有重要作用。

維生素P是一種植物次級代謝產(chǎn)物，為水溶性黃色或微綠色針狀結(jié)晶或粉末，又名蘆丁、檸檬素、橘皮素等等［6］。維生素P具有增強(qiáng)其它維生素功效、防止瘀傷、抗氧化及增強(qiáng)機(jī)體對傳染性疾病的抵抗作用，但尚未發(fā)現(xiàn)維生素P在豬精液低溫保存中的作用研究，本試驗(yàn)通過在豬精液稀釋液中添加不同濃度的維生素P，在保存不同時(shí)間內(nèi)對豬精液品質(zhì)進(jìn)行檢測，探索維生素P對低溫保存豬精液的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用豬精液由楊凌養(yǎng)豬服務(wù)中心提供，采自于一頭2歲大的長白種公豬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精子的采集和處理 采用手握法采集精液后，用BTS溶液按1∶1與豬精液混合，隨后用保溫杯于1h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，在400×顯微鏡下對精液樣品進(jìn)行觀察，選擇精子活力大于75%，精子形態(tài)異常率小于15%的樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。樣品于離心機(jī)中1200g／min離心10min，去上清，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后用將精子用加有不同濃度維生素P的Zorlesco稀釋液（按配方自備）稀釋，至精子終濃度為3×107／mL，用80mL 的豬精液低溫保存塑料瓶進(jìn)行分裝，然后用多層毛巾包裹，放于4 ℃冰箱進(jìn)行儲(chǔ)存，在保存不同時(shí)間后取出進(jìn)行精液進(jìn)行品質(zhì)檢測。

1.2.2 精子活力的測定 精子活力測定采用主觀評定方法。具體方法為：吸取40μL 精液至200μL離心管中，37 ℃水浴5min。然后吸取10μL 精液滴于37 ℃預(yù)熱的載玻片上，于400×光學(xué)顯微鏡下對精子進(jìn)行觀察，運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的比例即為精子的活力。

1.2.3 精子活率的測定 精子的活率評定采用苯胺黑－伊紅雙染的方法［7］。簡要描述如下：將精液于37 ℃水浴30min后，取50μL 精液與50μL 苯胺黑－伊紅溶液于室溫下孵育30s，接著吸取10 μL至載玻片上，制作精液涂片，在1000×油浸顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，對伊紅完全排斥的精子占總精子的比例即為該樣品的精子活率。

1.2.4 精子頂體完整率的測定 精子的頂體完整率采用異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的花生凝集素（FITC－PNA）染色的方法進(jìn)行［8］。簡要描述如下：取10 μL精液均勻涂抹于載玻片上并于室溫下風(fēng)干，用100%的酒精固定10min，然后用FITC－PNA 溶液對已經(jīng)固定好的樣品在37 ℃、濕潤、黑暗的環(huán)境下孵育30min，最后用PBS洗滌樣品兩次并于黑暗中風(fēng)干。將制作好的樣品在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，其中頂體被染為綠色的精子頂體損壞，相反，頂體無顏色或顏色非常淺的精子被認(rèn)為頂體功能完整，以此計(jì)算精子的頂體完整率。

1.2.5 精子質(zhì)膜完整性的測定 取50μL 低溫保存的精液與1mL的低滲腫脹溶液（含0.735%果糖和1.351%檸檬酸鈉）混合后于37 ℃水浴1h，取孵育好的精液10μL 滴于載玻片上并在1000×相差顯微鏡下精子進(jìn)行觀察，計(jì)算尾部彎曲的精子占總精子的比例即為精子的低滲腫脹率。

1.2.6 精子線粒體活性測定 線粒體活性檢測采用羅丹明123和碘化丙啶雙染的方法，其在Fraser的試驗(yàn)中有詳細(xì)介紹［9］。其方法為：取330μL儲(chǔ)存的精液并向其中加入2μL羅丹明123溶液于37℃下黑暗孵育15 min。然后加入10μL 碘化丙啶溶液（0.5mg／mL），37℃黑暗中繼續(xù)孵育10min。完成染色后的精子用500g／min 離心5min，棄上清，將沉淀溶于1mLPBS。取10μL 精液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400×熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。其中，精子被染為紅色的精子為死精子。未被染為紅色且精子中段被染為較深的綠色的精子為線粒體功能完整的精子，計(jì)算線粒體功能完整的精子比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素P對精子活力、活率、質(zhì)膜及頂體完整率的影響

從表1－2可以看出，加入不同濃度的維生素P在保存3d后，對豬精子的活率、活力和頂體完整率沒有影響（P＞0.05）。而在第3天時(shí)，添加160μg／mL和200μg／mL的維生素P顯著地提高了精子的質(zhì)膜完整性。與對照組相比，在第6天和第9天，加入維生素P 顯著提高了豬精子的活力、活率、頂體完整率和低滲腫脹率（P＜0.05）。

2.2 不同濃度的維生素P對精子線粒體活性的影響

從表3中可以看出，在第3天和第6天，維生素P的添加對精子線粒體活性的作用不明顯（P＞0.05）。在保存9d后，與對照組相比，添加維生素P顯著提高了豬精子的線粒體活性（P＜0.05）。

3 討論

維生素P是一種抗氧化劑，但是有關(guān)添加維生素P 對豬精液低溫稀釋液Zorlesco的作用的研究尚未見諸報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)中在豬精液低溫稀釋液中加入不同濃度的維生素P，并對儲(chǔ)存后精子三個(gè)時(shí)期的精子的各項(xiàng)微觀指標(biāo)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了維生素P對精子各項(xiàng)指標(biāo)具有提高作用。表明了維生素P對精液儲(chǔ)存具有保護(hù)作用。

國內(nèi)外對抗氧化劑在豬精液儲(chǔ)存過程中的作用的研究較多，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種抗氧化劑如?；撬?、半胱氨酸、生育酚、抗壞血酸等對來自綿羊、豬、牛及人的精子的儲(chǔ)存具有保護(hù)作用。Bucak等［10］在其研究中發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑谷氨酸能提高冷凍－解凍后安哥拉山羊的精液的質(zhì)膜完整率。Li等［11］對抗壞血酸和過氧化氫酶對人精液儲(chǔ)存的效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這兩種抗氧化劑能夠減輕精子的氧化應(yīng)激，進(jìn)而提高精子的活力。在綿羊的精液冷凍過程中，Maia等［12］研究表明，向Tris－卵黃冷凍稀釋液中加入過氧化氫酶能夠提高冷凍－解凍后精子的活力和活率。Pe?a等［13］研究顯示，抗氧化劑生育酚的加入對于提高豬精液冷凍－解凍后精子的線粒體活性。在本試驗(yàn)中，雖然采用的保存方式不同，但抗氧化劑的加入提高豬精液儲(chǔ)存過程中豬精子的活力、活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率和線粒體，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果是一致的。

表1 維生素P 對低溫條件下豬精子活力及活率的影響Table 1 Effect of vitamin P on motility and viability of boar sperm

表2 維生素P 對低溫條件下豬精子頂體完整率和質(zhì)膜完整性的影響Table 2 Effect of vitamin P on acrosome integrity and membrane integrity of boar sperm during chilled preservation

表3 維生素P 對低溫保存豬精子線粒體活性的影響Table 3 Effect of vitamin P on mitochondrial status during chilled preservation

精子的氧化應(yīng)激損傷是指精子在一系列外界條件的作用下，精子中過氧化氫、過氧化物及超氧根離子等自由基的過量產(chǎn)生而導(dǎo)致的精子損傷。豬精子的質(zhì)膜上含有較高的多不飽和脂肪酸，這使其容易受到氧化應(yīng)激損傷。氧化應(yīng)激能夠?qū)е戮踊盍突盥实南陆怠NA 損傷，從而導(dǎo)致精子受精能力的下降［14］。據(jù)報(bào)道，維生素P含有的鄰二羥基和雙鍵能夠幫助機(jī)體組織去除自由基并且阻止細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化［15］。本試驗(yàn)中，維生素P對豬精液低溫保存的保護(hù)作用，可能是由于維生素P中的抗氧化基團(tuán)減少了豬精子脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生。另一方面，精子具有自身抗氧化系統(tǒng)，它主要由精子性腺分泌的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）構(gòu)成。此外，精子中的非酶類抗氧化物質(zhì)如抗壞血酸、谷胱甘肽、尿酸、維生素E、類胡蘿卜素及泛醌等也參與了抗氧化系統(tǒng)的構(gòu)成?？寡趸到y(tǒng)能夠減小精子儲(chǔ)存過程產(chǎn)生的自由基對精子的損傷［16－17］。本試驗(yàn)中，維生素P所具有的對豬精子的保護(hù)作用也可能是由于維生素P在精子的儲(chǔ)存過程中，增強(qiáng)了精子自身所具有的抗氧化系統(tǒng)的能力；當(dāng)Zorlesco中維生素P 的濃度為200μg／mL 和250μg／mL時(shí)，其對豬精子的保存作用減弱，這很可能是由于高濃度的維生素P在減少氧化應(yīng)激對豬精子損傷的同時(shí)，造成了稀釋液本身理化性質(zhì)發(fā)生了改變，對精子的儲(chǔ)存產(chǎn)生了不利作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素P對儲(chǔ)存于4℃條件下的豬精子具有保護(hù)作用，其最適添加濃度為160μg／mL。

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