■張顏婷 趙國芬

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010010)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是具有共軛雙鍵的位置和幾何異構(gòu)體十八碳烯酸的統(tǒng)稱。其共軛雙鍵通常位于C9和C11位或C10和C12位，每個雙鍵可以以順式或反式構(gòu)型存在[1]。共軛亞油酸的立體異構(gòu)體多達十幾種，以cis-9,trans-11-CLA(c9t11)，trans-10、cis-12-CLA(t10c12)，trans-9、trans-11-CLA(t9t11)和 cis-10、cis-12-CLA(c10c12)等異構(gòu)體為主，其中具有生物學功能的兩種異構(gòu)體為cis-9、trans-11-CLA(c9t11)和 trans-10、cis-12-CLA(t10c12)[2]。研究表明，CLA具有諸多的生理功能，如抗癌、調(diào)節(jié)血糖、增強肌體免疫力、促進骨組織代謝、促進生長發(fā)育[3-8]、治療糖尿病[9]、減少皮膚感染[10]、減少脂肪[11]和抗動脈粥樣硬化[12-13]等，其在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域已經(jīng)成為研究的重點。

亞油酸異構(gòu)酶(linoleic acid isomerase，LAI）可以專一地將亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸。與目前應(yīng)用較為廣泛的化學異構(gòu)法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)CLA相比，利用重組菌誘導(dǎo)表達并純化產(chǎn)生的LAI催化亞油酸產(chǎn)生CLA，不僅可以獲得高活性、高純度的CLA，還解決了微生物發(fā)酵過程中發(fā)酵條件苛刻、菌體生產(chǎn)能力局限和菌體代謝產(chǎn)物不易與產(chǎn)品分離等問題。

本試驗以重組LAI工程菌為試驗菌株，對誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度進行單因素試驗和正交試驗研究，以進一步優(yōu)化重組LAI工程菌的誘導(dǎo)表達條件，為后續(xù)酶的純化、利用以及工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

亞油酸純度≥99%（Sigma）、氨芐青霉素（amresco）、IPTG（amresco）、牛血清白蛋白（Scientific Research Special）、正己烷（永大試劑）、蛋白胨（環(huán)凱微生物）、酵母提取物（環(huán)凱微生物）、Tris（amresco）、甘油（永大試劑）、咪唑（Vetec）、NaCl（永大試劑）、NTA-0、100、200、400分別為濃度20 mM Tris-HCl（pH值 7.9），0.5 M NaCl及10%甘油，添加0、100、200、400 mM咪唑、JM109-pQE30a-LAI(實驗室保存)。

1.2 菌種培養(yǎng)

將-80℃保存的重組菌接種于固體LB培養(yǎng)基上，劃線培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接于液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h即得種子液。

1.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化的單因素試驗

1.3.1 誘導(dǎo)時機的選擇

將種子液接于液體培養(yǎng)基，在37℃搖床中分別培養(yǎng)1、3、5、7、10 h，培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mM IPTG繼續(xù)37℃培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌，PBS洗滌，破碎菌體進行酶活力的測定。

1.3.2 誘導(dǎo)時間的選擇

將種子液接于液體培養(yǎng)基，在37℃搖床中培養(yǎng)7 h，培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mM IPTG繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為5、10、15、20、25 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌，PBS洗滌，破碎菌體進行酶活力的測定。

1.3.3 誘導(dǎo)劑濃度的選擇

將種子液接于液體培養(yǎng)基，在37℃搖床中培養(yǎng)7 h，培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)基中加入IPTG，終濃度分別為0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mM，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)15 h，培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌，PBS洗滌，破碎菌體進行酶活力的測定。

1.3.4 誘導(dǎo)溫度的選擇

將種子液接于液體培養(yǎng)基，在37℃搖床中培養(yǎng)7 h，培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1 mM IPTG繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)15 h，培養(yǎng)結(jié)束后離心收菌，PBS洗滌，破碎菌體進行酶活力的測定。

1.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行4因素3水平正交試驗。

1.5 菌體的破碎

稱菌體濕重，加入10倍體積的PBS，利用超聲波破碎儀對菌體進行破碎。破碎后，離心所得的上清液即為粗酶液。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測定

利用考馬斯亮藍法[14]對蛋白質(zhì)含量進行測定。

1.6.1 標準曲線的繪制

以PBS為溶劑，分別配制0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg∕ml的牛血清白蛋白溶液，分別取1 ml加入5 ml考馬斯亮藍G-250溶液，反應(yīng)5 min后搖勻，測定OD595nm，以牛血清白蛋白質(zhì)量（μg）為橫坐標，OD595nm為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6.2 樣品的測定

取適當稀釋后的樣品1 ml加入5 ml考馬斯亮藍G-250溶液，反應(yīng)5 min后搖勻，測定OD595nm，然后根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.7 酶活力的測定

1.7.1 標準曲線的繪制

以正己烷為溶劑，分別配制0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg∕ml的CLA溶液，測定OD233nm，以CLA質(zhì)量(μg)為橫坐標，OD233nm為縱坐標，繪制標準曲線。

1.7.2 亞油酸懸濁液的制備

取亞油酸 0.5 ml，Tween-80 0.5 ml，用去離子水99 ml，超聲乳化，即得亞油酸乳濁液。

1.7.3 酶活力的測定

取3 ml亞油酸乳濁液加入粗酶液200 μl，37℃振蕩培養(yǎng)2 h，向反應(yīng)液中加入10%三氯乙酸結(jié)束反應(yīng)，再加入10 ml正己烷進行振蕩萃取，測定OD233nm[15]。根據(jù)下述公式進行酶活力的計算。

式中：K——稀釋倍數(shù)；

G——生成的CLA含量（μg）；

V——取酶液的體積（ml)；

T——反應(yīng)時間（h）。

1.8 重組LAI誘導(dǎo)表達SDS-PAGE檢測

以正交試驗所得的最佳誘導(dǎo)表達條件對重組LAI進行誘導(dǎo)表達，對誘導(dǎo)表達效果進行SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)含量標準曲線的繪制

以不同濃度牛血清白蛋白與考馬斯亮藍G-250反應(yīng)后測定OD595nm值，以O(shè)D595nm為縱坐標，蛋白質(zhì)的質(zhì)量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線如圖1。

圖1 蛋白質(zhì)含量標準曲線

由圖1可知，蛋白質(zhì)含量標準曲線方程的R2=0.997 7，標準曲線具有可信性，可以使用。

2.2 CLA含量標準曲線的繪制

在233 nm處測定不同CLA濃度的正己烷溶液的OD233nm值，以O(shè)D233nm為縱坐標，CLA的質(zhì)量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線如圖2。

圖2 共軛亞油酸含量標準曲線

由圖2可知，共軛亞油酸含量標準曲線方程的R2=0.999 3，標準曲線具有可信性，可以使用。

2.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化的單因素試驗

2.3.1 誘導(dǎo)時機的選擇

對誘導(dǎo)時機分別為1、3、5、7、10 h誘導(dǎo)表達的LAI粗酶液進行了酶活力測定，結(jié)果如圖3。

圖3 誘導(dǎo)時機的選擇

由圖3可知，隨著誘導(dǎo)前菌體培養(yǎng)時間的延長，誘導(dǎo)表達的LAI的酶活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當誘導(dǎo)前培養(yǎng)時間為7 h時，酶活力最大達到3 074.5 U∕ml。由于IPTG能抑制菌體生長，過早的加入IPTG會導(dǎo)致重組菌菌體生物量偏低，產(chǎn)酶能力受限，此時誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活力較低；當重組菌生長進入對數(shù)期，隨著菌體的快速增殖，重組菌的產(chǎn)酶能力升高，誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活力不斷升高；當重組菌進入穩(wěn)定期后，菌體數(shù)目不再增加，但由于菌體生長產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以及有害物質(zhì)的積累，此時菌體的產(chǎn)酶能力與對數(shù)期時相比較差，誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活力有所下降。因此，重組LAI的最佳誘導(dǎo)時機為誘導(dǎo)前培養(yǎng)菌體7 h。

2.3.2 誘導(dǎo)時間的選擇

對誘導(dǎo)時間分別為5、10、15、20、25 h誘導(dǎo)表達的LAI粗酶液進行了酶活力測定，結(jié)果如圖4。

圖4 誘導(dǎo)時間的選擇

由圖4可知，隨著誘導(dǎo)時間的延長，誘導(dǎo)表達的LAI的酶活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當誘導(dǎo)時間達15 h時，酶活力達到最大，為3 182.3 U∕ml。由于培養(yǎng)時間為0～15 h時重組菌生長由延遲期到達穩(wěn)定期，這一時期內(nèi)LAI的誘導(dǎo)表達可以正常進行，所以酶活力不斷上升；而隨著時間的延長，20 h后重組菌生長進入衰亡期，菌體發(fā)生自溶和蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象，LAI也不可避免的被降解，所以酶活力出現(xiàn)下降的趨勢。因此，重組LAI最佳誘導(dǎo)時間為15 h。

2.3.3 誘導(dǎo)劑濃度的選擇

對誘導(dǎo)劑濃度分別為 0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mM誘導(dǎo)表達的LAI粗酶液進行了酶活力測定，結(jié)果如圖5。

圖5 誘導(dǎo)劑濃度的選擇

由圖5可知，隨著誘導(dǎo)劑IPTG濃度的增加，誘導(dǎo)表達產(chǎn)生的LAI活力出現(xiàn)先升后降趨勢，當IPTG濃度為0.1 mM時，LAI活力最大，可達2 527.1 U∕ml。由于誘導(dǎo)劑IPTG對于重組菌具有一定的毒害作用，低濃度的IPTG對重組菌毒害作用不明顯，但是對LAI誘導(dǎo)表達的效率也相對較低，此時LAI活力不高；隨著IPTG濃度的增加，IPTG對LAI誘導(dǎo)表達的效率增高，LAI活力增大；而當IPTG濃度進一步增高時，其對于重組菌的毒害作用也愈加明顯，導(dǎo)致重組菌生長受限，不能很好地表達LAI，使得LAI活力降低。因此，重組LAI最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mM。

2.3.4 誘導(dǎo)溫度的選擇

對誘導(dǎo)溫度分別為20、25、30、37℃誘導(dǎo)表達的LAI粗酶液進行了酶活力測定，結(jié)果見圖6。

圖6 誘導(dǎo)溫度的選擇

由圖6可知，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，誘導(dǎo)表達的LAI的酶活力出現(xiàn)先升后降的趨勢，當溫度為25℃時，LAI的酶活力最大，可達2 836.9 U∕ml。由于低溫誘導(dǎo)酶表達時，酶可以正確折疊，但酶的表達速率低，總體表現(xiàn)為酶活力不高；而隨著溫度的升高，酶的表達速率加快，酶活力也逐漸升高；但當溫度進一步升高時，酶折疊速率加快，致使形成的酶的高級結(jié)構(gòu)的錯誤率增高，總體表現(xiàn)為酶活力降低，因此，25℃為LAI誘導(dǎo)表達的最佳溫度。

2.4 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)正交試驗因素水平表進行L9(34)正交試驗，正交試驗設(shè)計見表1，試驗結(jié)果如表2和表3。

表1 正交試驗因素水平

由表2可知，最佳誘導(dǎo)條件為：A2B1C3D3，即誘導(dǎo)時機為誘導(dǎo)前培養(yǎng)菌體7 h、誘導(dǎo)時間為10 h、誘導(dǎo)劑濃度為0.15 mM、誘導(dǎo)溫度為30℃，各因素對正交試驗影響強弱關(guān)系為：B＞D＞C＞A。由于最佳誘導(dǎo)條件在正交試驗表中沒有對應(yīng)的試驗組，在最佳誘導(dǎo)條件下進行3組平行驗證試驗，3組試驗測得LAI酶活力結(jié)果分別為3 845.857 8、3 775.675 4、3 927.523 5 U∕ml，RSD=1.9741%，表明最佳誘導(dǎo)條件為A2B1C3D3時所得的LAI酶活力平均值為3 849.686 0 U∕ml。由表3可知，因素B、C、D對試驗結(jié)果影響極顯著，因素A對試驗結(jié)果影響不顯著。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

2.5 重組LAI的誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE檢測（見圖7）

由圖7可知，陰性對照菌JM109和JM109-pQE30a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)沒有目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，而重組菌JM109-pQE30a-LAI經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生了目的蛋白質(zhì)，且大小約為64 kD，與預(yù)期相符。這表明陰性對照菌本身并不產(chǎn)生LAI，只有轉(zhuǎn)入了LAI基因的重組菌才能經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生LAI，且產(chǎn)生的LAI大部分為可溶性的，有利于下一步親和層析純化LAI的進行。

圖7 重組LAI誘導(dǎo)表達SDS-PAGE檢測

3 結(jié)論

近年來，對于生物合成CLA的研究成為了食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點，隨著研究的深入，結(jié)合基因工程和酶工程的技術(shù)，純化出高活性、高純度的LAI，利用酶直接催化亞油酸產(chǎn)生共軛亞油酸的方法，顯示出了顯著的優(yōu)越性。本試驗通過對重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)時機為誘導(dǎo)前培養(yǎng)菌體7 h，誘導(dǎo)時間為10 h，誘導(dǎo)劑濃度為0.15 mM，誘導(dǎo)溫度為30℃。最佳誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)出的亞油酸異構(gòu)酶的酶活力平均可達3 849.686 0 U∕ml。與天然發(fā)酵法和化學合成法獲得LAI相比，優(yōu)化了誘導(dǎo)表達條件的重組菌誘導(dǎo)表達出的LAI，具有活性高、異構(gòu)體單一、利于純化等優(yōu)點，為后續(xù)酶的利用、開發(fā)和研究奠定了一定的基礎(chǔ)。