許曉燕，余夢瑤，魏 巍，江 南，羅 霞

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041)

〈生理生化〉

黃背木耳對正常小鼠免疫功能作用的影響*

許曉燕，余夢瑤，魏 巍，江 南，羅 霞**

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041)

研究黃背木耳對正常小鼠免疫功能的影響。通過小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗、血清溶血素抗體生成試驗、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗、小鼠碳粒廓清試驗等方法，測定黃背木耳對正常小鼠免疫功能的影響。黃背木耳能顯著有效的增強正常Balbc小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)免疫、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和NK細(xì)胞活性。黃背木耳能夠從細(xì)胞免疫功能方面達到增強正常小鼠免疫系統(tǒng)功能的作用。

黃背木耳；細(xì)胞免疫；體液免疫

黃背木耳Auriculariapolytricha，又名毛木耳、構(gòu)耳、粗木耳，是熱帶及亞熱帶地區(qū)主要食用菌之一，分類學(xué)上隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[1]，已在我國范圍內(nèi)廣泛栽種，其子實體富含碳水化合物、膠質(zhì)、腦磷脂、纖維素、卵磷脂、胡蘿卜素、鐵、磷、維生素B1、維生素B2、維生素C等物質(zhì)。黃背木耳不僅具有較高的營養(yǎng)價值，還具有較高的藥用價值，是藥食兩用真菌。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃背木耳具有活血、止血、止痛、抗腫瘤等功效[1-7]。

由于目前對黃背木耳免疫功能的系統(tǒng)研究較少，因此本研究從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性等方面研究黃背木耳對正常Balbc小鼠免疫系統(tǒng)的作用，為黃背木耳在保健品、藥品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃背木耳子實體，購自德陽食用菌專家大院。

綿羊紅細(xì)胞(SRBC)，采自健康綿陽頸靜脈；雞紅細(xì)胞(CRBC)，采自健康公雞心臟血；氧化型輔酶I，Sigma公司；一得閣墨汁，北京一得閣工貿(mào)公司；刀豆蛋白A(ConA)，Sigma公司；MTT，Sigma公司；補體4只健康豚鼠的混合血清。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平，德國賽多利斯股份公司；數(shù)顯游標(biāo)卡尺，上海塞拓五金工具有限公司；Model 1680型酶標(biāo)儀，BIO-RAD；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱，三洋電機國際貿(mào)易有限公司；WFJ7200分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃背木耳試樣的制備

黃背木耳子實體經(jīng)清洗、熟化、干燥處理后，粉碎過100目篩。取黃背木耳粉末適量，加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，使樣品完全分散，靜置10 min，使樣品充分吸脹，用蒸餾水定容至每毫升0.075 g樣品濃度的灌胃樣品。

1.3.2 動物分組與給藥

動物購回，基礎(chǔ)飼料喂飼3 d后，按隨機分組原則分為1 g·kg-1組、2 g·kg-1組和3 g·kg-1組和對照組。給藥組以相應(yīng)劑量的黃背木耳樣品，對照組以滅菌水灌胃，每天上午、下午各灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d。末次灌胃后對小鼠各項免疫功能指標(biāo)進行測定。

連續(xù)灌胃30 d后，稱取動物體重，頸推脫臼處死動物，取出脾臟、胸腺，分別稱出脾臟、胸腺重量。計算臟器體重比值(以mg10g表示)。

1.3.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)

在連續(xù)灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2%(v·v-1)SRBC 0.2 mL免疫，繼續(xù)灌胃4 d后，測量左后足跖厚度，測量3次取平均值，然后在測量部位皮下注射20%(v·v-1)SRBC，每只20 μL。注射后24 h測量左后足跖厚度，測量3次取平均值。計算攻擊前后足跖厚度的差值，以差值表示小鼠足跖增厚的程度[8,9]。

1.3.5 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(MTT法)

連續(xù)灌胃30 d后，頸椎脫臼處死動物，無菌取出脾臟，撕碎，過200目篩網(wǎng)后，用Hank’s液洗3次，用完全1640培養(yǎng)液配成3×106個·mL-1細(xì)胞懸液。將每份脾細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，1 mL·孔-1，2孔份樣品，1孔加75 uL ConA液(相當(dāng)于7.5 μg·mL-1)，1孔作為對照，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)68 h后，取出培養(yǎng)板，每孔輕輕吸取0.7 mL上清液，加入0.7 μL不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，以及50 μL MTT液(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打使紫色結(jié)晶完全溶解。將溶解液移入2 mL比色杯中，在570 nm波長處測定OD值[8]。

1.3.6 血清溶血素測定(血凝法)

在連續(xù)灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2%(v·v-1)SRBC 0.2 mL免疫，繼續(xù)灌胃5 d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置1 h，剝離， 2 000 r·min-1離心10 min，收集血清，用生理鹽水將血清作倍比稀釋，每份稀釋12孔，將不同稀釋度的血請置于血凝板中，每孔100 μL，再加入0.5%(v·v-1)SRBC懸液100 μL，混勻，置濕盒37℃約3 h后觀察結(jié)果，記錄每孔的凝集程度。計算抗體積數(shù)[8，9]。

1.3.7 抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法)

在連續(xù)灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2%(v·v-1)SRBC 0.2 mL免疫，繼續(xù)灌胃5 d后，頸椎脫臼處死小鼠，取出脾臟，撕碎，過200目篩網(wǎng)后，用Hank’s液洗3次，用完全1640培養(yǎng)液配成5×106個·mL-1細(xì)胞懸液備用。在含有0.5 mL(45℃～50℃)表層培養(yǎng)基的小試管中加入50 μL 10%(v·v-1)SRBC及20 μL己配好的脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，加于掛膜玻片上，凝固后，將玻片扣放在片架上，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h，在玻片架凹槽內(nèi)加入用稀釋的補體，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后，計數(shù)溶血抗體生成細(xì)胞數(shù)[8，9]。

1.3.8 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(半體內(nèi)法)

連續(xù)灌胃30 d后，每只小鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，30 min后，頸椎脫臼處死，將其固定在鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均滴于2張載玻片上，置濕盒37℃約30 min，取出在生理鹽水中漂洗、晾干、固定，4%Giemsa PBS染色3 min，蒸餾水漂洗晾干，鏡檢。計算吞噬百分率及吞噬指數(shù)[8]。

1.3.9 小鼠碳廓清試驗

連續(xù)灌胃30 d后，技0.0l mL·g-1從小鼠尾靜脈注入1∶4稀釋的印度墨汁，立即計時，分別于2 min，10 min從小鼠內(nèi)毗靜脈從取血20 μL，加到含2 mL濃度1 mg·mL-1Na2CO3溶液的試管中，混勻，用分光光度計，在600 nm波長處測定OD值(用1 mg·mL-1Na2CO3溶液作空白對照)[8，10]。

1.3.10 NK細(xì)胞活性測定(乳酸脫氫酶測定法)

連續(xù)灌胃30 d后，頸椎脫臼處死動物，取出脾臟，撕碎，過200目篩網(wǎng)后，用Hank′s液洗3次，用完全1640培養(yǎng)液配成2×106個·mL-1細(xì)胞懸液。將各只小鼠的細(xì)胞懸液取300 μL分置于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每孔加靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞，4×105個·mL-1)100 μL，同時做靶細(xì)胞自然釋放孔(靶細(xì)胞100 μL和培養(yǎng)液100 μL)及最大釋放孔(靶細(xì)胞100 μL和1%NP-40 100 μL各8孔，37℃、5%CO2培4 h，取出 1 500 r·min-1離心5 min。將各孔上清液100 μL置于另一培養(yǎng)板中，每孔再加入100 μL基質(zhì)液，10 min后加1 mol·L-1HCl 30 μL終止反應(yīng)，在490 nm處測定OD值。計算NK細(xì)胞活性率[8，9]。

1.3.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=0.2815,p=0.8384，各劑量組分別于對照組小鼠相比，其脾臟體重比值均無顯著性差異(p>0.05)，見表1。

表1 黃背木耳對小鼠臟器體重比值的影響

劑量動物數(shù)∕只脾臟(mg)∕體重(10g)比值(±s)胸腺(mg)∕體重(10g)比值(±s)對照組1048.11±3.5818.77±3.351g·kg-1組1048.88±5.7318.82±2.182g·kg-1組1048.38±4.0117.41±2.663g·kg-1組1049.94±5.9919.42±3.10

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=0.9345,p=0.4335，各劑量組分別于對照組小鼠相比，其胸腺體重比值均無顯著性差異(p>0.05)。

2.2 黃背木耳對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

黃背木耳對小鼠DTH的影響，見表2。

注：*表示與對照組相比，p<0.05。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=3.3349，p=0.0294；抗原攻擊后24 h，1 g·kg-1劑量組和2 g·kg-1劑量組與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度無顯著性差異(p>0.05)；3 g·kg-1劑量組與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度有顯著性差異(p<0.05)。

2.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法)

黃背木耳對鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，見表3。

注：*表示與對照組相比，p<0.05。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=3.1132，p=0.0374。1 g·kg-1劑量組和2 g·kg-1劑量組與對照組小鼠相比，其光密度差值均無顯著性差異(p>0.05)；3 g·kg-1劑量組與對照組小鼠相比，其光密度差值有顯著性差異(p<0.05)。

2.4 黃背木耳對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響

黃背木耳對小鼠血清溶血素抗體積數(shù)的影響，見表4。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=2.5437，p=0.0705。各劑量組分別與對照組小鼠相比，其抗體積數(shù)均無顯著性差異(p>0.05)。

2.5 抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法)

黃背木耳對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響，見表5。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=0.2079，p=0.8903。各劑量組與對照組小鼠相比，其抗體生成細(xì)胞數(shù)無顯著性差異(p>0.05)。

2.6 黃背木耳對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

2.6.1 吞噬百分率

黃背木耳對小鼠腹腔區(qū)噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞能力的影響，見表6。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=1.0863，p=0.3669。各劑量組分別與對照組小鼠相比，其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率均無顯著性差異(p>0.05)。

2.6.2 吞噬指數(shù)

從表6可以看出，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=0.4029，p=0.7517。各劑量組分別與對照組小鼠相比，其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)均無顯著性差異(p>0.05)。

2.7 小鼠碳廓清實驗

黃背木耳對小鼠碳廓清的影響，見表7。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=0.0109，p=0.9984。各劑量組與對照組小鼠相比，其吞噬指數(shù)α無顯著性差異(p>0.05)。

2.8 黃背木耳對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

黃背木耳對小鼠NK細(xì)胞活性影響，見表8。

注：*表示與對照組相比，p<0.05。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=3.3439，p=0.0291，1 g·kg-1劑量組和2 g·kg-1劑量組與對照組小鼠相比，其NK細(xì)胞活性率均無顯著性差異(p>0.05)；3 g·kg-1劑量組與對照組小鼠相比，其NK細(xì)胞活性率有顯著性差異(p<0.05)。

3 結(jié)論

[1]余夢瑤. 毛木耳抗腫瘤多糖組分的分離、抗腫瘤機制及不同毛木耳菌株遺傳差異性研究[D]. 成都：四川大學(xué)，2008.

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The Effect ofAuriculariapolytrichaon Mice Immunological Function

XU Xiao-yan, YU Meng-yao, WEI Wei, JIANG Nan, LUO Xia

(Sichuan Academy of Chinese Medicine Science, ChengduSichuan610041)

The immunological effect of the fruit body ofAuriculariapolytrichaon mice were studied. After administration of the fruit body ofAuriculariapolytrichafor 30 days consecutively with the dose of 1 g·kg-1, 2 g·kg-1and 3 g·kg-1BW, immunological indexed were measured. Delayed anaphylactic reaction was intensified, transformation of spleen lymphocytes in the mice was increased, and the NK activity was raised. The fruit body ofAuriculariapolytrichacan strengthen the immunofunction of mice.

Auriculariapolytricha; Cellular immunity; Humoral immunity

*項目來源：國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系藥用菌栽培崗位建設(shè)項目,編號：農(nóng)科教發(fā)[2007]12號；四川省精深加工研究崗位建設(shè)項目,編號：川農(nóng)業(yè)(2009)75號；菌類藥材研究與開發(fā)四川省科技創(chuàng)新團隊，編號：2011JTD0021；四川省十二五育種攻關(guān)項目“菌類藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的收集及新材料的選育，編號：2011NZ0098-12-04；四川省重大科技計劃項目“食藥用菌現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)鏈關(guān)鍵技術(shù)研究集成與產(chǎn)業(yè)化示范”，編號：2012NZ0003。

許曉燕(1980-)，女，助理研究員，研究方向為藥理學(xué)。E-mail: 4086014@qq.com

**通信作者：羅霞，副研究員，研究方向為藥理學(xué)。E-mail: 287748567@qq.com

2014-01-25

S646.6

A

1003-8310(2014)02-0035-04