韋廣輝 何林飛

高效液相色譜-熒光檢測法測定復(fù)方刺五加片中維生素B1的含量

韋廣輝 何林飛

目的 建立高效液相-熒光檢測法測定復(fù)方刺五加片中維生素B1含量。方法 采用PAKC18柱, 流動相為甲醇-0.02M乙酸銨(35:65), 流速為1.0 ml/min, 進(jìn)樣量為10 μl, 熒光檢測激發(fā)光波長為365 nm, 發(fā)射光波長為475 nm。結(jié)果 維生素B1含量在5~100 μg之間線性關(guān)系良好(r=0.9998), 平均回收率為98.12%, RSD=1.17%(n=6)。結(jié)論 方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、靈敏度高, 為制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

高效液相-熒光檢測法；復(fù)方刺五加片；維生素B1

復(fù)方刺五加片由刺五加浸膏、玉竹、黃芪、當(dāng)歸、維生素B1組成, 其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊, 尚未建立維生素B1含量測定項(xiàng)目。文獻(xiàn)報(bào)道［1］復(fù)方刺五加片中維生素B1的測定方法為高效液相-紫外檢測法, 鑒于熒光檢測具有較強(qiáng)的專屬性和高度的靈敏性, 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)維生素B1的理化特性與光譜特點(diǎn), 參考呂惠卿［2］采用高效液相-熒光檢測法對復(fù)方刺五加片中維生素B1進(jìn)行測定, 實(shí)驗(yàn)證明, 該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確,為制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀、G1321B熒光檢測器(美國Agilent公司), XS205DU電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。維生素B1對照品(中國藥品生物制品檢定研究院, 批號：10039-200703, 供含量測定用), 復(fù)方刺五加片(市售：批號分別為20130203和130104)。甲醇為色譜純, 其它試劑為分析純, 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：PAKC18鍵合硅膠柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：甲醇-0.02M乙酸銨(35:65), 激發(fā)光波長365 nm, 發(fā)射光波長475 nm;流速1.0 ml/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2溶液制備

2.2.1堿性鐵氰化鉀溶液 稱取鐵氰化鉀0.2 g, 加水10 ml,搖勻后加入0.1 g/ml氫氧化鈉400 ml, 搖勻, 即得。

2.2.2供試品溶液 取本品20片, 除去糖衣, 研細(xì), 精密稱取相當(dāng)于1片的量, 置100 ml量瓶中, 加水適量, 超聲提取5 min, 加水至刻度, 搖勻, 取溶液1.0 ml加水至10 ml, 加入堿性鐵氰化鉀溶液5 ml, 振搖2 min, 加入正丁醇10 ml, 振搖3 min, 放置, 取上清液過濾, 即得。

2.2.3對照品溶液 精密稱取維生素B1對照品10.16 mg,置200 ml量瓶中, 加水至刻度, 搖勻, 即得對照品貯備液, 精密量取1.0 ml, 同供試品溶液制備項(xiàng)下制得對照品溶液。

2.2.4陰性樣品溶液 稱取除維生素B1以外的其他藥材,照復(fù)方刺五加片的制備工藝和供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3干擾試驗(yàn) 按上述色譜條件, 分別精密吸取維生素B1對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl, 進(jìn)樣測定,供試品溶液主峰的保留時(shí)間與對照品溶液主峰的保留時(shí)間一致, 陰性樣品色譜圖在此保留時(shí)間無干擾。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取維生素B1對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 ml, 分別置于25 ml的比色管中,各管加水至10 ml, 同供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制得系列溶液。按上述色譜條件測定, 以濃度為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo), 得回歸方程為Y=10.900X-11.333, r=0.9998, 結(jié)果表明, 維生素B1在5~100 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次, 測定其峰面積, 其RSD=0.32%, 結(jié)果表明：該方法精密度較高, 能夠滿足實(shí)際樣品的測定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份, 按“供試品溶液制備”方法制備, 按上述條件測定, 結(jié)果的RSD=1.60%(n=6), 表明重復(fù)性好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液, 按上述色譜條件每隔3 h測定1次, 共計(jì)測定5次, 結(jié)果表明, 在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品細(xì)粉6份, 稱樣量相當(dāng)于半片重, 置100 ml量瓶中, 分別加入維生素B1對照品貯備液50 ml(濃度為0.05 mg/ml), 同供試品溶液的制備項(xiàng)下方法操作, 測定其維生素B1的含量, 結(jié)果平均回收率為98.12%, RSD=1.17%(n=6)。

2.9樣品含量測定 按“2.2.2”供試品溶液的制備方法和“2.1”色譜條件試驗(yàn), 測定兩批復(fù)方刺五加片中維生素B1的含量, 外標(biāo)法計(jì)算含量, 結(jié)果2批樣品含量分別為:批號：20130203, 4.92 mg/片, RSD1.43%;批號：130104, 4.97 mg/片, RSD1.28%。

3 討論

3.1測定波長的選擇 參考呂惠卿［2］測定波長, 并經(jīng)G1321B熒光檢測器多波長檢測, 結(jié)果表明:維生素B1在λex 365 nm, λem 475 nm處有最大響應(yīng)值, 故采用λex 365 nm, λem 475 nm作為檢測波長。

3.2流動相的選擇 選用甲醇-0.02M乙酸銨(35:65)作為流動相, 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明, 維生素B1峰與相鄰峰有效分離, 故選用甲醇-0.02M乙酸銨作為流動相［2］。

［1］ 杜波, 王金杰, 荊維榮.高效液相色譜法測定復(fù)方刺五加片中維生素B1的含量.中國傷殘醫(yī)學(xué), 2011, 19(2):27-28.

［2］ 呂惠卿.高效液相色譜-熒光檢測法測定復(fù)合維生素B片中維生素B1含量.中國藥業(yè), 2008, 17(15):24-25.

2014-05-16］

530022 廣西食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證審評中心(韋廣輝)；南寧食品藥品檢驗(yàn)所(何林飛)