樸軍顏 綜述，楊小昂 審校

(鄭州大學(xué)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州450052)

當(dāng)前，導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一為惡性腫瘤。WHO統(tǒng)計結(jié)果顯示，每年約有700萬人因腫瘤而死亡［1］，而且這一數(shù)字呈逐年遞增趨勢。腫瘤發(fā)生是一個長期累積的過程，受多基因控制和多因素調(diào)節(jié)。諸如手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療方法由于受適應(yīng)證、禁忌證和毒副反應(yīng)等因素的限制，治療效果仍不理想。20世紀(jì)80年代以來，隨著一系列鑒定腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)方法的逐漸建立，CTA的發(fā)現(xiàn)和鑒定成為可能，為腫瘤主動免疫治療和靶向治療的發(fā)展提供了新思路。

1 CTA的特征與CT基因的分類

與傳統(tǒng)療法相比，免疫治療具有特異性高、殺傷能力強、全身毒副反應(yīng)輕等優(yōu)點。腫瘤抗原能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，因而獲得特異性腫瘤抗原是開展免疫治療的關(guān)鍵所在。目前在眾多腫瘤相關(guān)抗原中，CTA 越來越引起研究者的關(guān)注與重視［2－4］。CTA具有以下特點:1)表達模式相同，即在除睪丸的正常組織中很少或幾乎不表達;2)大多數(shù)CTA家族的基因位于X染色體上，并且存在多個家族成員;3)在不同腫瘤組織中，CTA表達常常具有異質(zhì)性?，F(xiàn)有資料顯示:除睪丸外，一些正常組織也能表達CTA，例如SSX-2、NY-ESO-l、LAGE-1、RAGE-1 分別在甲狀腺、乳腺、子宮、視網(wǎng)膜組織中有所表達，但CTA在這些組織中的表達程度遠遠低于其在睪丸組織中的表達程度，而且這種低表達的生物學(xué)意義尚不明確。

CTA是公認的在腫瘤抗原中免疫原性最強的一類，能夠同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。在惡性腫瘤特異性免疫治療研究中，尋找表達CTA的基因已成為研究的最佳途徑。在人體已知47個CT基因家族中，能夠產(chǎn)生抗原反應(yīng)并引起細胞或體液免疫的約有20個［5－6］。應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)方法分析檢測可知，CT基因家族可分為3大類:1)具有T淋巴細胞識別特性的CT基因，如CT2、CT4和CT18等;2)抗體識別的 CT 基因，如 CT7、CT8、CT21、CT22、CT23、CT28、CT37、CT43 和 CT44 等;3)T 淋巴細胞和抗體共同識別的 CT 基因，如 CT1、CT5 和 CT6 等［7－8］。這些CT基因能夠編碼100個左右轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，大多數(shù)基因互不關(guān)聯(lián)而且不存在遺傳學(xué)進化鏈(CT1、CT3、CT7、CT10 及 CT4、CT12、CT16 有遺傳相關(guān)性)。根據(jù)CT基因所處的染色體不同，CT基因或基因家族又可以分為以下2大類:1)X-CT基因或基因家族，是一類定位于X染色體上的CT基因，約30種，如NY-ESO-1、MAGE、SSX基因家族等;2)定位于不同的常染色體上的非X-CT基因，多為非家族性基因，如SCP-1基因定位于1號染色體上，而OY-TES-1基因則定位于12號染色體上。目前已知47個CT基因或基因家族的命名依據(jù)是發(fā)現(xiàn)的時間順序［9］;通常在上述命名前還具有原標(biāo)識符，以此尊重原發(fā)現(xiàn)者。

2 CT基因的表達

在不同腫瘤組織中CT基因的表達有很大差異，如在惡性黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌組織中表達水平較高，而在結(jié)腸癌、腎癌等組織中表達水平較低;在同一類型的腫瘤組織中不同的CT基因表達水平也不盡相同，如MAGE-A1、NY-ESO-1和SSX-4的表達較高，而BAGE-A1和SCP-1的表達則相對較低;同一家族的不同CTA在腫瘤組織中的表達也不盡相同，如SSX家族中SSX-2和SSX-4在腫瘤組織中表達率較高，而SSX-1、SSX-3和SSX-5的表達率則較低;另外，CT基因的表達還呈現(xiàn)簇生趨勢。

免疫治療理想的條件是CT基因?qū)δ[瘤細胞的存活起關(guān)鍵作用并且其表達具有特異性及穩(wěn)定性，而在腫瘤旁組織與正常組織中幾乎不表達。目前許多研究者通過大量的實驗證明DNA甲基化是CT基因調(diào)控的機制并且在CT基因的表達調(diào)控中起著重要作用［10-11］。Kim 等［12］的研究表明，DNA 低甲基化與核纖層結(jié)構(gòu)相關(guān)，能夠抑制CTA在腫瘤細胞中的表達，而且腫瘤細胞內(nèi)的DNA甲基化與生殖細胞內(nèi)特定的基因有關(guān)。

3 CTA的鑒定方法

鑒定CTA的方法主要有免疫學(xué)方法和基因表達分析法。20世紀(jì)90年代，研究者采用T淋巴細胞抗原決定簇克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了CT1、CT2和CT4等基因，并證實這些基因僅存在于正常人體的睪丸和部分惡性腫瘤組織中;通過血清學(xué)表達克隆技術(shù)得到了與CT1存在的范圍類似的CT5、CT6和CT8等基因。后來研究者通過mRNA表達分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)了更多的CT基因，如運用代表差異性分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了CT10和CT14;用差異顯示技術(shù)和寡核苷酸序列分析技術(shù)，分別找到了CT11和CT25;利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析表達序列標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，得到了CT9、CT16、CT32和CT44等。然而，利用mRNA表達分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)的某些CT基因并不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

3.1 T細胞表位克隆技術(shù) Boon小組于1991年創(chuàng)立該鑒定方法并發(fā)現(xiàn)了MAGE-1/CT1.1、BAGE/CT2、GAGE1/CT4等［13］。目前利用此方法鑒定的腫瘤抗原主要為黑色素瘤抗原。然而由于采用這種方法需要建立自體靶細胞株而分離腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞，然而建立細胞株在許多腫瘤中困難較大并且敏感度低，因此這種方法不適用于鑒定常見的乳腺癌和結(jié)腸癌的腫瘤抗原。

3.2 多肽洗脫法 該方法是指結(jié)合生物化學(xué)手段洗脫可以引起腫瘤特異性T淋巴細胞應(yīng)答的腫瘤抗原肽，這些腫瘤抗原肽可以在腫瘤細胞表面或主要組織相容性復(fù)合體分子上結(jié)合，質(zhì)譜分析技術(shù)來確定腫瘤抗原肽的氨基酸組成，與腫瘤抗原肽相應(yīng)的腫瘤抗原可以通過數(shù)據(jù)庫檢索確定［14］。這種方法盡管可獲得CTA的天然多肽，但其對儀器及技術(shù)方面的要求過高，現(xiàn)階段很難滿足其發(fā)展的需要。高靈敏度質(zhì)譜儀的問世和應(yīng)用的普及可以為這一技術(shù)的發(fā)展注入新的活力。

3.3 cDNA表達文庫的血清學(xué)篩選分析技術(shù) 是一種篩選腫瘤抗原的技術(shù)，其基于血清學(xué)分析和基因重組技術(shù)篩選臨床腫瘤標(biāo)志物，成為鑒定和發(fā)展腫瘤疫苗的重要措施。經(jīng)其鑒定的CTA主要有SSX2/CT5.2、NY-ESO-1/CT6 和 SYCP-1/CT8 等［15］。

3.4 基因表達分析法 是一系列分析方法的綜合，涵蓋了差異顯示技術(shù)、代表性差異分析技術(shù)、cDNA芯片分析技術(shù)、基因表達連續(xù)性分析技術(shù)、表達序列標(biāo)簽測序及大規(guī)模平行信號測序等。例如，Liang等［16］利用差異顯示技術(shù)鑒定了CTp11/SPANX/CT11等;大量研究［17-19］采用代表性差異分析技術(shù)先后鑒定了LAGE-1/CT6.2、MAGE-E1/CT10和SAGE/CT14等。隨后研究者通過cDNA芯片分析技術(shù)、基因表達連續(xù)性分析技術(shù)、表達序列標(biāo)簽測序技術(shù)及大規(guī)模平行信號測序技術(shù)陸續(xù)鑒定了MMA-1A/CT25.1、MAGEC2/CT7.2、PAGE-1、XAGE-1/CT12 和 CT45 等［20-24］。

3.5 生物信息學(xué)方法 是以SAGE及EST數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，通過該方法發(fā)現(xiàn)的新CT基因有BRDT、PAGE-4、PAGE-5、LDHCMAGE-B6、MAGE-C3、XAGE、CT15、CT17 等［25-31］。

4 CTA與免疫治療

現(xiàn)階段關(guān)于CTA研究尚處于基礎(chǔ)階段，甚至很多問題還不太清楚，但可以明確的是，CT基因及其編碼產(chǎn)物CTA在細胞分化及增殖、細胞凋亡、信號傳導(dǎo)、惡性腫瘤細胞耐藥、基因轉(zhuǎn)錄、減數(shù)分裂、精子發(fā)育等方面起著重要作用［32-35］。Suri等［32］研究發(fā)現(xiàn) SPAG9 是一種影響細胞增殖分裂以及腫瘤發(fā)生的CTA，在卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌與結(jié)腸癌組織中的陽性表達率分別是90%、88%、82%、88%和74%，而在這些腫瘤組織中能夠產(chǎn)生體液免疫的概率依次為67%、80%、80%、77%、74%。由此可見，SPAG9具有很好的免疫治療應(yīng)用潛力，能夠用來制備T淋巴細胞或B淋巴細胞表位多肽疫苗、樹突狀細胞疫苗以及單克隆抗體。Hudolin等［33］發(fā)現(xiàn)在睪丸淋巴瘤細胞中MAGEA1和NY-ESO-1LAGE-1共同存在時，兩者各自的表達水平均比單獨存在時要高得多，這將為多種CTA協(xié)同用于免疫治療提供充分依據(jù)。de Carvalho等［34］的研究表明，多發(fā)性骨髓瘤細胞能夠表達多種CTA，其中能夠特異性表達的是MAGE-C1/CT7，其定位于X染色體上，對這種疾病的發(fā)生和診斷有重要作用，但將MAGE-C1/CT7用于多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療還需要進一步的體內(nèi)外實驗以及臨床數(shù)據(jù)。另外，Rappu等［35］通過高靈敏度和高時間分辨率的熒光分析檢測法，在黑色素瘤患者血清中檢測出CT16基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這一研究發(fā)現(xiàn)為CTA用于免疫治療開拓了新的途徑。

對于腫瘤疫苗的制備有2個方面的要求:1)這種分子是能夠在腫瘤組織中特異性表達的內(nèi)源性物質(zhì);2)具有激發(fā)腫瘤免疫應(yīng)答的特性，而CTA則同時具備上述條件而成為腫瘤疫苗研究的熱點［36-37］。在腫瘤免疫治療研究中，CTA的優(yōu)勢是能夠選擇性激發(fā)腫瘤患者體內(nèi)的特異性細胞及體液免疫反應(yīng)，而對正常機體沒有作用。

用MAGE-3(1999年)和NY-ESO-1(2000年)制備的疫苗可以在患者體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，但具體療效仍難以評價［38-39］。目前中國藥品食品監(jiān)督管理局藥審中心已通過了CT抗原NY-ESO-1b多肽疫苗的評定，NY-ESO-1b多肽疫苗能夠誘導(dǎo)肝癌患者產(chǎn)生特異性的細胞免疫應(yīng)答，進而有效遏制術(shù)后殘留腫瘤細胞，有望成為一種有效的腫瘤輔助治療手段。

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