王富敏 于繼徐 車峰遠(yuǎn)

(臨沂市人民醫(yī)院，山東 臨沂 276000)

目前全世界肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)發(fā)病率約為(4～6)/100 000，臨床主要表現(xiàn)為緩慢起病、進(jìn)行性發(fā)展的肌肉無力、肌萎縮、肌束震顫、腱反射亢進(jìn)和病理征陽性?；颊咭话愣嘤诎l(fā)病3～5年后因呼吸肌麻痹、呼吸衰竭而死亡，只有10%的患者生存期超過10年〔1〕，目前暫無特效治療辦法〔2，3〕。根據(jù)其發(fā)病形式，可分為散發(fā)性ALS(sALS)和家族性ALS(fALS)，其中fALS約占全部病例的10%。約10%～20% fALS患者與編碼Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)1基因的錯義突變或小片段缺失相關(guān)〔4，5〕?？蓪?dǎo)致fALS的突變基因包括SOD1、反式激活應(yīng)答(TAR)結(jié)合蛋白及肉瘤融合脂肪肉瘤轉(zhuǎn)錄蛋白(FUS/TLS)的基因編碼突變〔6〕。另外，C71G、M114T、E117G和G118V四種突變也已在fALS中被發(fā)現(xiàn)〔7〕。ALS發(fā)病機制可能主要集中在Cu/Zn SOD突變、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體功能不良、細(xì)胞骨架異常、蛋白聚集及遺傳因素等〔8，9〕。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致慢性運動神經(jīng)元變性死亡的主要因素〔10〕。而在 ALS 治療中應(yīng)用的一些外源性抗氧化劑(如 N-乙酰半胱氨酸、維生素 E、褪黑素等)其治療效果并不令人滿意〔11～13〕。目前研究認(rèn)為，機體在產(chǎn)生氧化應(yīng)激的同時，體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)也會被激活，從而抑制氧化應(yīng)激所造成的損傷，使機體處于防御平衡狀態(tài)。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)通路是體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中至關(guān)重要的一條通路。Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者〔14〕，在細(xì)胞介導(dǎo)的抗氧化防御反應(yīng)中具有重要的作用。近幾年，Nrf2-ARE通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用已日益得到重視?，F(xiàn)就Nrf2-ARE通路與ALS發(fā)病機制的關(guān)系及在ALS治療中的前景進(jìn)行綜述。

1 Nrf2-ARE通路的基本結(jié)構(gòu)

1.1Nrf2基本結(jié)構(gòu) Nrf2 是一種66 000的蛋白質(zhì)，其有一個基本的亮氨酸結(jié)構(gòu)域，屬于CNC-bZIP，即CNC 亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族，該家族有6個成員，包括NF-F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、BTB-CNC異體同源體(Bach)1和Bach2。Nrf2 是其家族成員中活力最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，幾乎在各種細(xì)胞中均可表達(dá)。在Nrf2基因中含有多個同源結(jié)構(gòu)域，分別命名為(Neh)1～6。Neh1有一個CNC型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，是Nrf2與DNA及與其他NF結(jié)合形成二聚體的必要條件〔15〕。Nrf2與DNA 的NF-E2 區(qū)的ARE序列(GTGACTCAGCA)結(jié)合，兩者結(jié)合之后可以啟動下游目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔16〕。因此，在細(xì)胞防御過程中，Nrf2可以通過ARE 來調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種細(xì)胞防御蛋白(比如：NQO1、GST、HO-1、Ferritin等)，以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

1.2ARE基本結(jié)構(gòu) ARE主要存在于Ⅱ相代謝酶基因啟動子5′端調(diào)控區(qū)，在NF及信號通路方面有著重要的增強作用。研究表明，ARE的核心序列為5′-TGACnnnGC-3′是誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶和親電子物質(zhì)轉(zhuǎn)錄活化所必需的，其5′端基因在激活后可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的保護性基因〔17〕。其激活后能夠調(diào)節(jié)包括抗氧化防御因子和抗炎癥因子在內(nèi)的多種蛋白酶的基因表達(dá)。

2 Nrf2-ARE信號通路的調(diào)節(jié)

在生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中絕大部分的Nrf2與其抑制性蛋白胞質(zhì)接頭蛋白(Keap)1相結(jié)合，處于非活性狀態(tài)，Nrf2中的Neh2 結(jié)構(gòu)域是其結(jié)合部位；而胞核中則有一少部分的Nrf2以活性狀態(tài)形式存在，以介導(dǎo)下游基因的基本轉(zhuǎn)錄。當(dāng)機體暴露于氧化應(yīng)激或親電子物質(zhì)時，胞質(zhì)中的Nrf2 就會從Keap1-Nrf2 的復(fù)合物中解離，從而被激活。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2激活的方式主要有3種〔18〕：①氧化劑或親電子試劑可以通過修飾Keap1上的半胱氨酸巰基來改變Keap1蛋白的構(gòu)象，從而導(dǎo)致Keap1蛋白與Nrf2解耦聯(lián)。②通過Nrf2的磷酸化使Keap1與Nrf2解耦聯(lián)。通過細(xì)胞外信號途徑如蛋白激酶C(PKC)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-JunN端蛋白激酶(JNK)及P38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)等的活化使Nrf2上的蘇氨酸和絲氨酸磷酸化，導(dǎo)致Nrf2構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而使得Nrf2與Keap1解耦聯(lián)。但在這兩種激活方式中，均因Nrf2-Keap1二聚體解耦聯(lián)而導(dǎo)致Nrf2蛋白升高，都屬于轉(zhuǎn)錄后修飾。因此，在Nrf2蛋白升高的同時Nrf2在mRNA水平卻基本保持不變。③如纖維生長因子家族的成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-1、-7、-10，則主要是通過上調(diào)Nrf2 mRNA水平進(jìn)而導(dǎo)致Nrf2蛋白表達(dá)升高，使得處于活性狀態(tài)的Nrf2增多。

解耦聯(lián)后的Nrf2由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與其他NF(比如：c-Jun和小Maf蛋白)結(jié)合形成二聚體，從而識別ARE序列并與之結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)其調(diào)控的靶基因表達(dá)下游的抗氧化蛋白和解毒酶，以保護機體免受活性物質(zhì)(如氧自由基)及一些毒性物質(zhì)(如致癌物、藥物代謝活性產(chǎn)物等)的侵害。Nrf2-ARE調(diào)控的分子主要是細(xì)胞內(nèi)的保護蛋白，如Ⅱ相解毒酶、SOD、還原型輔酶1(NQO1)，抗氧化酶、谷胱甘肽(GSH)合成代謝相關(guān)酶、抗炎蛋白等〔19〕。

3 Nrf2-ARE信號通路與ALS

3.1氧化應(yīng)激與ALS 在ALS病人尸解的生物化學(xué)和組織病理學(xué)研究中顯示，在ALS患者體內(nèi)存在著脂質(zhì)過氧化〔20〕、核酸氧化、蛋白糖基化、蛋白硝化及與蛋白相結(jié)合的羰基水平明顯增高〔21〕等氧化應(yīng)激的證據(jù)。在ALS病人血漿和腦脊液檢查中也發(fā)現(xiàn)了8-羥基-2-脫氧烏苷酸(8OHDG)、4-羥基王烯醛(4-HNE)、硫代巴比妥酸反應(yīng)(TBARS)、3-硝基酪氯酸(3-NT)等這些氧化應(yīng)激產(chǎn)物的增加。有學(xué)者〔22〕在fALS病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗氧化酶Cu/ZnSOD1的突變。這些都充分說明了氧化應(yīng)激確實參與了 ALS 的發(fā)病。但目前，針對氧化應(yīng)激是否是神經(jīng)元變性的主要原因或者是它僅僅是其他毒性損傷所致的結(jié)果，這一點仍不明確。對于病因已經(jīng)明確的hSOD1突變轉(zhuǎn)基因動物，其毒性致病機制也仍不清楚，目前大部分學(xué)者認(rèn)為，SOD1活性的丟失并不足以導(dǎo)致疾病的發(fā)生，很可能是由于SOD1的突變形成了新的突變酶，產(chǎn)生了未知的新功能從而對細(xì)胞有毒性損傷作用。而且研究表明，突變的hSOD1產(chǎn)生的毒性并不僅僅局限于對運動神經(jīng)元細(xì)胞，它還涉及其他類型的細(xì)胞，因此，運動神經(jīng)元的存活需依靠不同類型的細(xì)胞之間的相互作用〔23〕。

3.2Nrf2與ALS 在體外或動物實驗研究中，許多抗氧化劑已經(jīng)表現(xiàn)出了對運動神經(jīng)元的保護作用，而在這一過程中Nrf2蛋白是一個關(guān)鍵分子。Nrf2/ARE 通路下游的抗氧化酶和抗氧化蛋白包括 NQO1、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)運酶(GST)、血紅素氧合酶1(HO-1)和鐵蛋白在內(nèi)源性抗氧化過程中發(fā)揮了重要的作用。Nrf2蛋白的表達(dá)早已在神經(jīng)變性疾病病人尸解的大腦組織中進(jìn)行過研究，并且發(fā)現(xiàn)，在這些疾病中Nrf2受到損傷，而且在Nrf2-ARE信號通路中由于受損的Nrf2而導(dǎo)致細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激損傷的防御能力下降，增加了運動神經(jīng)元在應(yīng)激誘導(dǎo)的毒性損傷中的易損性〔24〕。幾項研究報告表明〔25〕，破壞了Nrf2分子及其下游信號通路會進(jìn)一步加重惡化細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷、炎癥反應(yīng)和線粒體功能障礙。在ALS尸解的大腦和脊髓組織中也發(fā)現(xiàn)，Nrf2的mRNA水平降低而Keap1的mRNA水平是升高的〔26〕。而應(yīng)用Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑干預(yù)ALS體外器官脊髓培養(yǎng)模型，可激活Nrf2-ARE通路，誘導(dǎo)NQO1、HO-1等表達(dá)上調(diào)，降低氧化應(yīng)激水平，對蘇-羥天冬氨酸(THA)誘導(dǎo)的選擇性運動神經(jīng)元損傷具有明顯保護作用〔27，28〕。Neymotin等〔29〕在運動神經(jīng)無樣細(xì)胞(NSC)-34 G93A SOD1細(xì)胞模型中研究發(fā)現(xiàn)，未加干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)Nrf2的活性只有輕微的上調(diào)，而且Nrf2沒有轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。但是，當(dāng)給予細(xì)胞CDDO-TFEA培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，NRF2會轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，而且在Western印跡中也發(fā)現(xiàn)，NRF2調(diào)控的下游蛋白分子(NQO1、HO-1、GST-α3)表達(dá)增加；與之相符的是，在細(xì)胞免疫組化和RT-PCR結(jié)果分析中也出現(xiàn)下游蛋白的表達(dá)上調(diào)。緊接著他們又在轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，在接受CDDO-EA和CDDO-TFEA治療的小鼠脊髓切片中，NQO1、HO-1和GST-α3等抗氧化基因上調(diào)，而與神經(jīng)炎癥相關(guān)的基因〔比如：繡導(dǎo)型-氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶(COX)-2、Fas配體(Fasl)、腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕出現(xiàn)下調(diào)。而且與對照組相比，治療組的小鼠的運動性能明顯提高，體重下降也明顯減少，更重要的是可以延長轉(zhuǎn)基因小鼠的生存時間。最近Vargas等〔30〕研究也表明，在神經(jīng)元細(xì)胞或是在Ⅱ型骨骼肌纖維細(xì)胞中Nrf2有限的過表達(dá)能夠延遲ALS發(fā)生，但是不能夠延長其生存時間。這些證據(jù)表明，Nrf2-ARE信號通路在ALS中可以對抗氧化應(yīng)激損傷，保護神經(jīng)元，同時，也為其成為潛在的ALS治療靶點提供了依據(jù)。

眾所周知，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對于其相鄰的神經(jīng)元具有支持、營養(yǎng)及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和興奮性的作用，并且與神經(jīng)元相比，膠質(zhì)細(xì)胞具有更強的抗氧化損傷的能力。星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能障礙已經(jīng)在一些神經(jīng)變性疾病中被發(fā)現(xiàn)，在ALS研究證據(jù)表明〔31〕，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以向細(xì)胞外間隙分泌GSH，而且之前在許多不同的模型研究中也已表明〔32〕：GSH水平升高可能是導(dǎo)致Nrf2激活發(fā)揮保護作用的一個重要原因，因而可以增高星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍的神經(jīng)元抗氧化防御能力，從而保護神經(jīng)元。最近有報道，在ALS老鼠模型的脊髓運動神經(jīng)元中，氧化型GSH水平增加而還原型水平在降低〔33〕，并且在相同模型中發(fā)現(xiàn)，GSH減少能夠加劇神經(jīng)功能損傷和線粒體病理性改變〔34〕。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2-ARE通路激活劑特丁基對苯二酚(tBHQ)能夠顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GSH的合成和分泌，抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親相力受體(p75NTR)依賴的共培養(yǎng)運動神經(jīng)元的凋亡〔35〕。最近，Vargas等〔36〕發(fā)現(xiàn)，SOD1突變的星形細(xì)胞對周圍的運動神經(jīng)元具有ALS的毒性作用，而星形細(xì)胞在膠質(zhì)酸性蛋白誘導(dǎo)下的Nrf2高表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)這種毒性，并且明顯提高了小鼠的生存時間。因此，目前這些數(shù)據(jù)表明，可以試圖激活星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2-ARE通路來保護運動神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷。在 ALS 病人運動神經(jīng)元中異常線粒體的形態(tài)已經(jīng)得到了病理學(xué)上的證實〔37〕。線粒體損傷可以使得氧自由基的產(chǎn)生增多。在不同類型的細(xì)胞中，線粒體的損傷可能引發(fā)一系列不同的反應(yīng)。比如，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，線粒體的損傷會產(chǎn)生促炎分子，這對神經(jīng)元細(xì)胞及其他周圍的細(xì)胞會產(chǎn)生毒性損傷。炎癥反應(yīng)又會加重神經(jīng)元在氧化應(yīng)激中的損傷。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)又會破壞線粒體和其他細(xì)胞器，最終形成一個惡性循環(huán)導(dǎo)致神經(jīng)元變性、死亡〔38〕。據(jù)報道〔39〕，Nrf2能夠調(diào)節(jié)線粒體生成的啟動基因，如線粒體轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接參與對線粒體的保護作用，從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)作為神經(jīng)變性疾病受累組織中的一個特征性改變，主要表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞局部反應(yīng)性聚集及相應(yīng)炎性因子的改變。這種炎性反應(yīng)與神經(jīng)元氧化損傷、線粒體功能障礙及蛋白質(zhì)異常聚集相關(guān)，因此調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應(yīng)可以對疾病的進(jìn)展產(chǎn)生影響〔40〕。David 等〔41〕應(yīng)用免疫組化法研究轉(zhuǎn)基因小鼠，證明在 ALS 發(fā)病早期，脊髓及其周圍神經(jīng)就有小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集，并伴隨著下運動神經(jīng)元的胞體及軸突病變。但是，在炎癥過程中，COX-2、iNOS等抗炎作用僅僅是部分依賴Nrf2通路的誘導(dǎo)，其抗炎效能與Nrf2的誘導(dǎo)之間的關(guān)系仍然需要進(jìn)一步明確〔42〕。

4 展 望

眾多研究表明，Nrf2-ARE信號通路在ALS中具有神經(jīng)保護作用，但是它所介導(dǎo)的一系列抗氧化機制，是疾病的發(fā)病機制還是繼發(fā)于疾病出現(xiàn)及與其他發(fā)病機制之間的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。目前，雖然有較多的Nrf2激動劑，但尋找對人體安全有效且能順利透過血腦屏障的藥物仍是一大挑戰(zhàn)。隨著研究的深入開展，或許Nrf2-ARE信號通路能夠為ALS治療提供新的思路。

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