才仁卓瑪 扎洛 李蘭英

青海紅十字醫(yī)院（西寧，810000）

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，占婦科惡性腫瘤之首，在發(fā)展中國(guó)家及發(fā)達(dá)國(guó)家的少數(shù)民族中發(fā)病率較高，可能與這些民族的文化差異、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀態(tài)、衛(wèi)生條件差異、缺乏健康知識(shí)等因素有一定的關(guān)系。人乳頭瘤病毒（HPV）感染已被證明是宮頸癌的直接病因，HPV誘發(fā)宮頸癌通常要經(jīng)歷感染、感染長(zhǎng)期持續(xù)、誘發(fā)癌前病變、進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的過程［1］。世界范圍內(nèi)的研究結(jié)果顯示，不同 HPV亞型在不同地區(qū)和不同種族中存在差異，對(duì)不同種族人群致癌性的強(qiáng)弱也明顯不同［2］。本研究旨在通過對(duì)高原地區(qū)181例藏族宮頸癌患者HPV型別分布進(jìn)行分析，為高原地區(qū)宮頸癌防治、HPV疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2010年3月～2013年9月在本院診斷為宮頸癌的藏族婦女宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本作為研究標(biāo)本，患者來自本省6個(gè)藏族自治州（即玉樹、果洛、海南、海北、海西、黃南）及部分海東地區(qū)，共181例。均為農(nóng)牧民，年齡26～70歲，平均年齡42歲。宮頸鱗癌177例，腺癌4例。

1.2 儀器與試劑

多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（KP－CT48）、Hybri－Max醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、HPV DNA提取試劑盒和HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自凱普生物化學(xué)有限公司。對(duì)所有宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行21種HPV亞型檢測(cè)［4］，包括15種高危型 HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）和6種低危型 HPV（HPV 6、11、42、43、44、CP8304）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集及保存 用棉拭子先除去宮頸口處多余的分泌物，用凱普專用宮頸刷伸入宮頸內(nèi)2～3cm處轉(zhuǎn)動(dòng)3～5圈，取出宮頸刷放入含有細(xì)胞保存液的帶蓋樣本管中，放置4℃冰箱中，在2周內(nèi)檢測(cè)。

1.3.2 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增 宮頸刷頭充分漂洗，洗脫液，離心，棄上清液保留管底細(xì)胞，加入裂解液按試劑盒說明書提取DNA，抽提好的DNA樣本作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR Mix、Tap酶和DNA模板按試劑盒說明書要求混勻，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照與陽性對(duì)照，常規(guī)PCR反應(yīng)，退火溫度55℃，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 導(dǎo)流雜交 雜交儀及雜交液45℃預(yù)熱后，在雜交平臺(tái)上放入標(biāo)記有21種HPV基因型寡核苷酸探針的低密度基因芯片，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加熱變性冰浴后，加入檢測(cè)孔內(nèi)進(jìn)行導(dǎo)流雜交；用封阻液封閉膜，排除封阻液后加入酶標(biāo)液，25℃溫育3.5min。用沖洗緩沖液徹底沖洗膜后加入NBT/BOIP底物顯色3～5min。在顯色后1h內(nèi)分析結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果判斷 肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽性點(diǎn)呈現(xiàn)清晰的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，根據(jù)HPV分型分布圖判斷HPV亞型，如果出現(xiàn)≥1個(gè)HPV分型點(diǎn)則為單一或多重HPV感染，高危型HPV陽性或高危型和低危型HPV同時(shí)陽性者均視為高危型HPV感染，僅低危型HPV陽性者視為低危型HPV感染。生物素對(duì)照點(diǎn)（Biotin，反映酶與顯色液反應(yīng)）和內(nèi)對(duì)照點(diǎn)（IC，質(zhì)控模板DNA探針）出現(xiàn)陽性，表示結(jié)果正確。肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，多個(gè)圓點(diǎn)陽性即為多重感染。每張芯片上有PCR反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)和雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)各一個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況

181例藏族宮頸癌患者中HPV陽性170例，感染率為93.92%（170/181）。其中單一感染者156例，均為高危亞型感染，占宮頸癌患者的86.19%（156/181），占 HPV 陽性宮頸癌患者的 91.76%（156/170）；HPV多重感染者14例，占宮頸癌患者的7.73%（14/181），占 HPV 陽性宮頸癌患者的8.24%（14/170）。

2.2 HPV各亞型分布

181例宮頸癌樣本中，檢測(cè)出13種HPV亞型（12種高危亞型和1種低危亞型）。HPV各亞型出現(xiàn)的頻率排序：16 型 71.18% （121/170）、58 型14.71% （25/170）、52 型 5.29% （9/170）、18 型4.71%（8/170）、53型4.12%（7/170）、39型2.35%（4/170）、45型1.76%（3/170）、66和68型1.18%（2/170）、33、35、59和6型0.59%（1/170）。

2.3 HPV多重感染各亞型分布

181例宮頸癌樣本中，單一感染156例，占HPV陽性宮頸癌患者的91.76%（156/170），各亞型感染率由高到低依次為 HPV16、58、52、18、53。以HPV16單一感染為主共108例，占單一感染總數(shù)的63.23%（108/156），其次為 HPV58共21例，占單一感染總數(shù)的13.46%（21/156）。多重感染為14例，占宮頸癌患者的7.73%（14/181），占 HPV陽性宮頸癌患者的8.24%（14/170）。以二重感染為主，共13例（92.86%，13/14），均為 HPV16的合并感染，即 HPV 16＋58、16＋53、16＋39、16＋18、16＋45、16＋52、16＋66、16＋6，其中以 HPV16＋58最為常見（4/13），其次為 HPV 16＋53/16＋39各2例（，2/13）。三重感染1例（1/14），為 HPV 33＋59＋66，均為高危亞型，未見HPV16合并感染。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病具有經(jīng)濟(jì)、地理、人群及種族等分布特點(diǎn)，世界癌癥組織的多中心研究提示［3－4］，不同國(guó)家不同地區(qū)HPV感染率不同，但是與宮頸癌的分布相一致。Das等［5］發(fā)現(xiàn)印度婦女宮頸癌中HPV－DNA檢出率高達(dá)98%，我國(guó)海南地區(qū)宮頸癌患者中HPV感染率為94%［6］，本研究中宮頸癌患者HPV感染率為93.92%，與其他地區(qū)的報(bào)道基本一致。不同的地區(qū)流行的基因型有所不同，全球HPV感染率為10.4%、非洲22.1%、亞洲8.0%、歐洲 8.1%［7］。西 藏 地 區(qū) 9.19%［8］、青 海 地 區(qū)16.72%［9］、高 原 地 區(qū) 藏 族 19.50%［10］，北 京 地 區(qū)57.1%［11］。各地差異很大，總體上欠發(fā)達(dá)地區(qū)宮頸癌發(fā)病率高于較發(fā)達(dá)地區(qū)；地理位置而言，宮頸癌發(fā)病率農(nóng)村比城市高、山區(qū)比平原高、內(nèi)地比沿海高［12］；種族而言，世界范圍內(nèi)非洲裔美國(guó)人、拉丁美洲人、美洲印第安人的宮頸癌發(fā)病率較高［13］。

HPV在人群和宮頸癌患者中的分布呈現(xiàn)明顯的地域特征，不同亞型HPV感染致癌性及其后果不同。世界范圍內(nèi)共同的最常見的亞型為HPV16和18，HPV16在所有HPV陽性的宮頸癌患者中的平均感染率為57.4%［14］。古扎麗努爾.阿不力孜等［15］報(bào)道的新疆維吾爾族宮頸癌 HPV16感染占94.31%，是目前發(fā)現(xiàn)HPV16感染率最高的地區(qū)。同樣在不同的地區(qū)，除了HPV16，宮頸癌中 HPV其他型別的比例會(huì)有些差異，按照地區(qū)分類前5位分別為：非洲 HPV16、18、33、45、35；亞洲 HPV16、18、58、33、52；歐洲 HPV16、18、33、31、45［7］。2007年一項(xiàng)橫跨我國(guó)7個(gè)宮頸癌發(fā)病率不同地區(qū)的19家醫(yī)院開展的多中心研究結(jié)果顯示［7］，在宮頸癌患者中最常發(fā)現(xiàn)的 HPV DNA類型是 HPV16、18、31、52、58。本地區(qū)藏族婦女HPV常見亞型依次為HPV16、58、52、53、18［10］，本研究中宮頸癌 HPV 常見亞型為 HPV16、58、52、18、53，分布相似，有民族和地域的分布特點(diǎn)。HPV16出現(xiàn)的頻率最高，排在第2位的 HPV58占14.71%，其頻率明顯低于HPV16，與上述多個(gè)地區(qū)的研究結(jié)果不同。HPV52排在第3位，作為西方國(guó)家主要型別的HPV18相對(duì)少見，排在第4位，之后是HPV53，在青海地區(qū)和高原藏族婦女常見亞型中亦排名第4，HPV53可能是本地區(qū)和藏族相對(duì)其他地區(qū)和民族的優(yōu)勢(shì)型別。

HPV持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變的直接病因，而HPV多重感染是否促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生一直是學(xué)者們關(guān)注的問題。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，多重感染并不增加宮頸癌的發(fā)生。大量研究提議持續(xù)感染同一種HPV高危型可能會(huì)加快個(gè)體的病變，但HPV高危型多重感染在宮頸病變的進(jìn)展中是否起重要作用尚不明確［16］。文獻(xiàn)報(bào)道 HPV的多重感染率從17.5%至58.9%不等［17］。在國(guó)際癌癥研究組織（IARC）所進(jìn)行的研究中，病例組多重感染為8.1%，對(duì)照組13.9%，對(duì)照組多重感染率較高，認(rèn)為多重感染與宮頸病變的級(jí)別無關(guān)，多重感染并不增加宮頸癌的發(fā)生［18］。本研究結(jié)果也顯示，藏族宮頸癌以單一高危型HPV感染為主，多重感染占7.73%。

青海高原地處青藏高原東北部，海拔大多在4000m以上。藏族人口集中在高寒、缺氧、經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生條件落后、交通不便的6個(gè)藏族自治州，以游牧生活為主。單一的飲食結(jié)構(gòu)、家庭式分娩，感染各種病原體的機(jī)會(huì)多、就診機(jī)會(huì)少。患陰道炎、宮頸炎及宮頸糜爛不能及早得到診治，從而增加了HPV感染的機(jī)會(huì)，使得藏族婦女患宮頸癌的幾率也隨之增加。宮頸癌是感染性疾病，預(yù)防HPV感染可以預(yù)防宮頸癌。發(fā)展農(nóng)牧區(qū)經(jīng)濟(jì)，改善交通和居住條件，加大對(duì)基層的醫(yī)療投入，增強(qiáng)衛(wèi)生保健知識(shí)的普及，提高婦女的衛(wèi)生要求，加大對(duì)各種生殖道疾病的防治力度，同時(shí)對(duì)農(nóng)牧區(qū)婦女進(jìn)行定期的宮頸癌普查，以降低高原地區(qū)藏族婦女宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。

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