桑軍軍 鄧淑文 郭凱 潘煒華 廖萬清

(1.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003;2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院血液科，上海 200433)

1 醫(yī)學(xué)真菌保藏的背景及意義

微生物菌種保藏是一項(xiàng)重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作。為此，在國際上一些發(fā)達(dá)的國家中都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)。例如:美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、荷蘭的真菌保藏中心 (Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)、英國的國家典型菌種保藏所 (National CollectionofTypeCultures，NCTC)等。我國也設(shè)有多個(gè)菌種保藏中心，涉及工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)等多個(gè)方面。例如中國普通微生物管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。近10 a來，由于廣譜抗菌藥、糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物、免疫抑制劑等藥物的廣泛應(yīng)用，以及各種器官移植術(shù)、導(dǎo)管介入治療、放射治療等多種醫(yī)療手段的開展，人為地改變了微生物與宿主之間的關(guān)系，造成了患者體內(nèi)菌群失調(diào)，為真菌感染提供了良好的環(huán)境［1］。隨著老齡化的加快、HIV感染患者增加、惡性腫瘤的發(fā)病率增加，真菌感染的易感人群也在增大［2］。各種抗真菌藥物的頻繁使用，導(dǎo)致真菌菌株的耐藥性越來越嚴(yán)重。所以對(duì)真菌病流行病學(xué)、致病機(jī)理、耐藥機(jī)理以及防治策略的研究尤為重要，而所有研究的基礎(chǔ)都建立在對(duì)醫(yī)學(xué)真菌的進(jìn)行有效的保藏。醫(yī)學(xué)真菌的保藏對(duì)研究其致病機(jī)理、耐藥趨勢、系統(tǒng)進(jìn)化都有重要意義。

2 醫(yī)學(xué)真菌保藏的原理及要求

醫(yī)學(xué)真菌保藏的原理同其他微生物的保藏原理相同。通過低溫、干燥、隔絕空氣等方法，降低真菌的新陳代謝，最大的延長其保藏時(shí)間。理論上，只要至少滿足其中一個(gè)條件，就可以對(duì)菌種進(jìn)行保藏。

醫(yī)學(xué)真菌保藏的要滿足3個(gè)條件:1)保持菌株的純度和活性;2)維持形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及致病力的穩(wěn)定;3)保持基因的完整性，避免菌株變異。

3 醫(yī)學(xué)真菌保藏的方法

目前醫(yī)學(xué)真菌的保藏方法有很多種。主要有定期移植法、液體石蠟法、無菌蒸餾水法、濾紙法、冷凍保藏法、冷凍干燥保藏法等，可以把醫(yī)學(xué)真菌保藏總結(jié)為以下幾種方法。

3.1 傳代培養(yǎng)保藏法

傳代培養(yǎng)法是將菌種定期接種到適宜菌株生長的培養(yǎng)基上，然后放入室溫或4℃保藏。斜面接種傳代保藏法是最常用的方法。它可用于實(shí)驗(yàn)室中各類醫(yī)學(xué)真菌的保藏，而且簡單易行，且不要求任何特殊的設(shè)備。但是此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、基因突變、菌株污染等現(xiàn)象。在臨床工作中，傳代培養(yǎng)法需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力，而臨床上收集到的大量病原真菌很難按照其要求進(jìn)行定期的轉(zhuǎn)接。因此此法適用于少量菌株的短期保藏，不適宜大量菌株的長期保藏。一般酵母菌于4℃保藏，每4～6個(gè)月移接1次;絲狀真菌 (霉菌)于4℃保藏，每6個(gè)月移接1次。

3.2 蒸餾水保藏法

蒸餾水保藏法是將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器密封，于室溫或4℃等溫度保藏。蒸餾水保藏法對(duì)于大部分醫(yī)學(xué)真菌的長期保藏是十分有效的。Fernandez等［3］對(duì)102株保藏在蒸餾水中的組織胞漿菌和隱球菌(92%菌株保藏時(shí)間＞10 a)進(jìn)行復(fù)蘇，莢膜組織胞漿菌、新生隱球菌和格特隱球菌的成活率分別為 64.3%、79.1% 和 100%。Dana［4］在對(duì)在蒸餾水中5℃保藏20 a的69株擔(dān)子菌綱的菌株進(jìn)行復(fù)蘇，82.6%的菌株仍然有很強(qiáng)的活力。Bueno等［5］觀察了曲霉等26中絲狀真菌在蒸餾水中的保藏情況，在2 a內(nèi)全部都有活性，未發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。Andrew等［6］對(duì)保藏在蒸餾水中2個(gè)月～21 a的179株真菌進(jìn)行了復(fù)蘇，其復(fù)蘇率達(dá)到了90%。章強(qiáng)強(qiáng)等對(duì)蒸餾水法和冷凍干燥法對(duì)78株菌株保藏情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，12 a后其生存率分別為89.7%和87.2%。結(jié)果表明，蒸餾水保藏法是簡單、廉價(jià)和可靠的保藏方法［7］。但是也有研究顯示，菌株在蒸餾水長期保藏其某些性狀可能會(huì)發(fā)生改變，例如形態(tài)學(xué)和一些酶類的改變。Katia等人對(duì)白念珠菌常溫蒸餾水保藏和SDA培養(yǎng)基保藏180 d前后進(jìn)行形態(tài)學(xué)和酶學(xué)的方法鑒定，其形態(tài)及酶的產(chǎn)生均有所改變［8］。蒸餾水保藏法長期保藏對(duì)菌種形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及基因的影響還有待進(jìn)一步研究。對(duì)于條件有限的基層醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室，蒸餾水保藏法是一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的長期保藏菌株的方法。

3.3 隔絕空氣法

隔絕空氣法是將礦物油、甘油、液體石蠟等對(duì)菌株生長無害的基質(zhì)覆蓋于培養(yǎng)基上，是菌株浸入基質(zhì)中以達(dá)到隔絕空氣的目的。以礦物油保藏法為例，將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入滅菌的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1 cm為宜，并以橡皮塞代替封口，豎直放置于室溫下或4℃冰箱中保藏。保藏時(shí)間延長一般為1～2 a。Manoel等人觀察了礦物油保藏對(duì)傘枝犁頭霉和布氏犁頭霉形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)礦物油不影響其營養(yǎng)和無性生殖形態(tài)［9］。要注意的是，某些菌株能利用石蠟為碳源，還有些菌株對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有可以利用基質(zhì)或?qū)|(zhì)敏感的菌株應(yīng)避免用此種方法保藏。此方法簡便有效，不需要特殊的設(shè)備，不需要經(jīng)常轉(zhuǎn)種，可用于大部分醫(yī)學(xué)真菌的保藏，特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。但是保存時(shí)，需要直立放置，所占空間較大，且不便于攜帶和轉(zhuǎn)移。

3.4 載體保藏法

載體保藏法是將真菌吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙、有孔玻璃珠、脫水明膠上，而后進(jìn)行干燥，以保藏菌種［10-11］。此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。以沙土保藏法和濾紙保藏法為例。沙土保藏法是將真菌孢子懸液加入滅菌的沙土中，經(jīng)真空干燥后，于低溫或常溫保藏，保存期可長達(dá)十年。濾紙保藏法是將要要保藏的真菌孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。其方法是將濾紙剪成小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，取出后放入滅菌小試管中，在真空干燥機(jī)上抽干，冷藏。Renata等［12］觀察了沙土保藏法對(duì)雙相真菌的活性、形態(tài)學(xué)和二態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)雙相真菌很難在土壤中長期保藏。

3.5 冷凍保藏法

冷凍保藏法是將菌株放入低溫保藏的方法，可分為低溫冰箱保藏法 (-20℃、-40℃、-80℃)、干冰保藏法(約-70℃)和液氮保藏法 (-196℃)。通過冷凍，將真菌體內(nèi)水分凝結(jié)，從而降低其代謝速度，達(dá)到長期保藏的目的。以-80℃冰箱保藏法為例，先離心收獲對(duì)數(shù)生長中后期或穩(wěn)定期的真菌，用新鮮培養(yǎng)基懸浮后加入等體積的冷凍保護(hù)劑，混勻后分裝入冷凍管中，以1℃/min控制性降溫至-30℃左右，于-80℃超低溫冰箱中保藏。很多因素影響保藏菌株的活力、表型及其潛在的基因完整性，它們包括保藏溫度、保護(hù)劑的種類、保藏前的狀態(tài)、降溫速度、融解速度等［13］。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好，液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。但是在冷凍的過程中，會(huì)出現(xiàn)凍傷的現(xiàn)象。凍傷來源于pH的改變、緩沖液的凝結(jié)、溶解的氣體、電解質(zhì)濃度變化、細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶、菌體收縮等因素。水凝結(jié)的物理效應(yīng)可以破壞細(xì)胞膜［14］，低溫過程中冰晶的產(chǎn)生可能會(huì)給細(xì)胞帶來致命的傷害。所以在保藏過程中，降溫和融解的過程是需要控制的，慢速的降溫和快速的融解可以得到較高的復(fù)活率。一般認(rèn)為-1℃/min對(duì)大多數(shù)醫(yī)學(xué)真菌都是安全的［14］。在菌種復(fù)活時(shí)，要盡快融解，可以放到菌種正常生長溫度的水浴鍋里融解。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意，通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑，例如甘油、海藻糖、DMSO等。Gujjari等［15］研究了啤酒酵母在4種保護(hù)劑 (DMSO、甘油、山梨醇、蔗糖)在2種溫度 (-80℃、液氮)下菌株保藏情況。8種不同保藏模式下的菌株分別在5個(gè)時(shí)間點(diǎn) (0、6、20、40、55個(gè)月)取出。以山梨醇為保護(hù)劑在-80℃保藏的菌株在20個(gè)月后，活力下降了90%，其余7種模式，都很好的保持了菌株的活力，這說明山梨醇不適合作為啤酒酵母的保護(hù)劑，甘油、DMSO、蔗糖都可以作為有效的保護(hù)劑。為了驗(yàn)證不同模式對(duì)菌種DNA的可能影響，Gujjari觀察了一個(gè)營養(yǎng)缺陷株在保藏過程中回復(fù)突變的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-80℃保藏40個(gè)月和55個(gè)月后，其回復(fù)突變率顯著增高，而且突變率與活性的降低呈正相關(guān)性變化。液氮保藏則回復(fù)突變沒有隨時(shí)間有明顯的變化，液氮保藏優(yōu)于-80℃保藏。不過，冷凍法不適用于某些不耐低溫的菌株，如蛙糞霉屬以及毛癬菌屬的部分真菌 (如Trichophyton concentricum、Trichophyton schoenleinii等)［7，16］不適合低溫保藏。

冷凍保藏法，特別是液氮超低溫保藏，存活率高，突變率低，保藏時(shí)間長，是世界培養(yǎng)物保藏協(xié)會(huì)(WFCCs)推薦的方法之一，但是其缺點(diǎn)是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難，需要低溫冰箱，液氮罐等特殊設(shè)備。

3.6 冷凍干燥保藏法

冷凍干燥保存法是使微生物在冷凍狀態(tài)下，然后在真空減壓的情況下利用升華現(xiàn)象除去水份，是微生物在非劇烈，避免細(xì)胞直接損傷的情況下處于干燥、缺氧狀態(tài)，使細(xì)胞的新陳代謝減慢，從而達(dá)到長期保藏的目的［17］。具體方法為將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的真菌與保護(hù)劑 (例如脫脂牛奶)混勻后，取適量加入安瓿管中，在-40℃冰箱預(yù)凍2 h，置于冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥8～20 h，熔封，測定真空度，合格后室溫或4℃保藏。在冷凍干燥的過程中為了盡量減少細(xì)胞損傷，加入保護(hù)劑十分必要，保護(hù)劑可分為小分子保護(hù)劑(如低聚糖類、醇類、緩沖鹽類、氨基酸和維生素類)和大分子保護(hù)劑 (如蛋白質(zhì)、多肽類和多糖類)。作為小分子保護(hù)劑，一般具有很強(qiáng)的親水性，分子結(jié)構(gòu)含有3個(gè)以上氫鍵，在冷凍或干燥過程中，可與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。而大分子保護(hù)劑通過“包裹”形式保護(hù)菌體，同時(shí)，促進(jìn)低分子保護(hù)劑發(fā)揮作用［18］。保護(hù)劑類型的選擇主要取決于菌株。目前用的比較多的保護(hù)劑包括血清、脫脂牛奶、糖類、甘油、二甲亞砜、谷氨酸鈉等。冷凍干燥保藏技術(shù)適用于一些產(chǎn)孢子的真菌，特別是一些能夠產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子的真菌，保藏周期可達(dá)到 20 ～ 40 a［19］。Bond［20］介紹了英國國家酵母菌保藏中心(NCYC)的保藏方法，并認(rèn)為真空冷凍干燥保藏法適用于絕大對(duì)數(shù)酵母。Tan等［21］介紹了荷蘭菌種保藏中心 (CBS)的保藏方法，冷凍干燥保藏法已用于50 000株菌株的保藏。張俊達(dá)等［22］觀察了常見醫(yī)學(xué)真菌真空冷凍干燥保藏后存活情況。結(jié)果顯示，皮膚癬菌的存活率達(dá)91.6%，酵母樣菌總存活率為83.5%，深部真菌總存活率為83.4%，腐生真菌總存活率為75%。但是冷凍干燥保藏法對(duì)真菌形態(tài)學(xué)，生理學(xué)以及基因水平的影響有待進(jìn)一步研究。Cavalcante等［23］用形態(tài)學(xué)，生物化學(xué)和隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)標(biāo)記的方法對(duì)8株冷凍干燥保藏的隱球菌進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)，莢膜大小以及RAPD條帶均有變化。

冷凍干燥保藏法法是醫(yī)學(xué)真菌菌種長期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10 a之久而不喪失活力，而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸，但操作過程復(fù)雜，需要冷凍干燥機(jī)等設(shè)備條件。

4 總 結(jié)

根據(jù)世界培養(yǎng)物保藏協(xié)會(huì) (WFCCs)的指南，不同的微生物要根據(jù)其自身特點(diǎn)選擇適宜的保藏方法以保持其最佳活性和純度。為了最大限度的減少菌種丟失的可能性，每個(gè)菌株至少用兩種方法保藏，其中至少有一種保藏方法為冷凍干燥保藏或者保藏到液氮中或-140℃的超低溫保藏 (http://www.wfcc.info/guidelines/)。與菌株保藏相關(guān)的工作也十分重要。每一個(gè)要分配一個(gè)唯一的編碼，用形態(tài)學(xué)的方法或者ITS測序鑒定到種，盡量包含更多的信息，包括生長曲線、顯微照片、代謝資料、基因指紋圖譜等。保藏之前必須要檢測其純度，菌株的活力應(yīng)該在保藏前、保藏中和復(fù)活后進(jìn)行被檢測并記錄。為了確保沒有生理學(xué)或基因水平的改變，可以對(duì)生長速率、形態(tài)學(xué)也可以進(jìn)行代謝和基因水平的評(píng)估［17］。

雖然目前超低溫保藏法和冷凍干燥保藏法是長期保存微生物菌種的最安全、可靠的方法，但是不同種屬的菌種又有其特異性。Crespo等［24］觀察了-80℃保藏、冷凍干燥法、蒸餾水保藏法、傳代法對(duì)馬拉色菌保藏的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有-80℃保藏能成功的復(fù)活所有的菌株。Deshmukh［25］對(duì)239菌皮膚癬菌通過斜面?zhèn)鞔?、蒸餾水懸浮法、礦物油法、二氧化硅干燥法、土壤保藏法以及冷凍干燥保藏法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果說明一些簡單的方法如蒸餾水懸浮法，斜面接種法等復(fù)活率也達(dá)到了令人滿意的效果。各個(gè)單位和實(shí)驗(yàn)室保藏條件也不盡相同，要根據(jù)自己的實(shí)際選擇最科學(xué)，經(jīng)濟(jì)和有效的保藏方法。

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