張放，楊飛

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院老年病科，沈陽(yáng) 110044）

糖尿病合并肺結(jié)核患者肺部病灶組織中細(xì)胞因子的表達(dá)及意義

張放1，楊飛2

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院老年病科，沈陽(yáng) 110044）

目的比較單一肺結(jié)核與糖尿病合并肺結(jié)核患者的肺部病灶組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的表達(dá)，探討肺結(jié)核、糖尿病合并肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能變化及其意義。方法 應(yīng)用免疫組化SABC法檢測(cè)13例肺部良性病變患者、45例單一肺結(jié)核患者、15例糖尿病合并肺結(jié)核患者的肺部病灶組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的表達(dá)，并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度（AOD）進(jìn)行定量比較，AOD值采用秩變換后，進(jìn)行方差分析，采用LSD檢驗(yàn)方法進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果 TNF?α、IFN?γ及IL?10在壞死區(qū)周?chē)仔苑磻?yīng)帶表達(dá)明顯，糖尿病合并肺結(jié)核組中TNF?α、IFN?γ的AOD值低于肺結(jié)核組（P<0.05），而IL?10的AOD值高于肺結(jié)核組（P<0.05）；肺結(jié)核組TNFα、IFN?γ的AOD值高于對(duì)照組（P>0.05），而IL?10的AOD值低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 TNF?α、IFN?γ、IL?10這些細(xì)胞因子參與了肺結(jié)核的局部免疫反應(yīng)；糖尿病患者存在局部細(xì)胞免疫反應(yīng)降低。調(diào)節(jié)糖尿病患者局部組織中的細(xì)胞因子，將可能成為糖尿病合并肺結(jié)核患者免疫治療的一種新的途徑。

TNF?α；IFN?γ；IL?10；糖尿??；肺結(jié)核

糖尿病患者易并發(fā)肺結(jié)核，其發(fā)病率大約為10%～15%，與非糖尿病患者比較，糖尿病患者感染肺結(jié)核的發(fā)病率是其2～5倍［1］。這可能與糖尿病患者的Th1型相關(guān)細(xì)胞因子及一氧化氮酶低表達(dá)，限制了宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)相關(guān)［2］。而在肺結(jié)核患者中，主要以Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，糖尿病患者的細(xì)胞免疫功能下降，使機(jī)體不易清除結(jié)核分枝桿菌。天然免疫細(xì)胞因子TNF?α、Th1型相關(guān)細(xì)胞因子IFN?γ，它們抗結(jié)核分枝桿菌的作用已得到認(rèn)可［3，4］。而Th2型相關(guān)細(xì)胞因子IL?10，在結(jié)核分枝桿菌感染的過(guò)程中作用尚不完全確定。目前對(duì)糖尿病合并肺結(jié)核的研究多是關(guān)于血漿中各細(xì)胞因子的表達(dá)水平［5］，不能準(zhǔn)確反應(yīng)病灶的局部細(xì)胞免疫水平。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)糖尿病合并肺結(jié)核患者肺部病灶組織中的TNF?α、IFN?γ、IL?10進(jìn)行檢測(cè)，使人們進(jìn)一步了解肺結(jié)核及糖尿病合并肺結(jié)核的局部免疫，探討糖尿病在肺結(jié)核患者中對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對(duì)象：選擇2009年4月至2010年9月在沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院住院并行肺葉切除術(shù)患者，男50例，女患23例，年齡25～66歲。

1.1.2 分組：（1）對(duì)照組：選取同期住院的其他肺部良性病變患者13例，男9例，女4例，年齡（50±6）歲，其中炎性假瘤3例、錯(cuò)構(gòu)瘤1例、曲菌球1例、支氣管擴(kuò)張7例及肺炎1例。取手術(shù)切除的肺組織病變周?chē)恼７谓M織。（2）肺結(jié)核組：選取住院的單一肺結(jié)核患者45例，男29例，女16例，年齡（44±8）歲。（3）糖尿病合并肺結(jié)核組：選取同期住院的糖尿病合并肺結(jié)核患者15例，男12例，女3例，年齡（48±7）歲；均為2型糖尿病，病史1～10年。術(shù)前平均血糖（9.7±3.2）mmol/L，術(shù)后平均血糖（8.2±2.3）mmol/L，手術(shù)前后血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。3組年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

1.1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核診斷均由病理證實(shí)。2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)按2010年ADA糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）糖化血紅蛋白A1c≥6.5%或（2）血糖FPG≥7.0mmol/L。空腹定義為至少8h內(nèi)無(wú)熱量攝入或（3）口服糖耐量試驗(yàn)時(shí)2h血糖≥11.1mmol/L或（4）在伴有典型的高血糖或高血糖危象癥狀的患者，隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L。而在無(wú)明確高血糖時(shí)，應(yīng)通過(guò)重復(fù)檢測(cè)來(lái)證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)（1）～（3）。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病，心、腎功能衰竭，支氣管結(jié)核，腫瘤；人免疫缺陷病毒陽(yáng)性；近期應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：分別收集3組肺組織（1cm×1cm×1cm），用生理鹽水沖洗干凈，置10%甲醛液固定24h后，低溫石蠟包埋，制成石蠟切片。

1.2.2 測(cè)定方法：（1）標(biāo)本處理：常規(guī)切片行HE染色復(fù)查診斷；（2）免疫組化方法：采用免疫組織化學(xué)染色SABC法，所有試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，染色時(shí)一抗均為兔抗人的多克隆抗體，工作濃度均為1∶150，二抗為山羊抗兔IgG。按試劑盒提示進(jìn)行操作。（3）結(jié)果判斷：顯微鏡下觀察各組中HE染色后的組織結(jié)構(gòu)，觀察免疫組化反應(yīng)的定位、分布及染色強(qiáng)度，每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的著色為棕黃色和棕褐色，并且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>5%認(rèn)為陽(yáng)性表達(dá)。每例均設(shè)有HE切片作對(duì)照觀察，并設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，用IPP6.0（image pro plus6.0）分析圖片，計(jì)算平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有定量資料的描述，若正態(tài)分布，以±s表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析或采用LSD檢驗(yàn)方法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF?α、IFN?γ及IL?10在各組的免疫組化染色結(jié)果

TNF?α、IFN?γ在對(duì)照組中以胞質(zhì)及胞膜為主的較淡少量的棕黃色改變；肺結(jié)核組在上述部位的表達(dá)增多，在胞質(zhì)及胞膜呈棕黃、褐黃色改變，明顯高于背景顏色，且分布不均勻、呈散在分布、局灶性表達(dá)；而在糖尿病合并肺結(jié)核組表達(dá)最弱。IL?10的表達(dá)以胞質(zhì)及胞膜為主，在肺結(jié)核組表達(dá)最弱，糖尿病合并肺結(jié)核組較結(jié)核組增強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

2.2 TNF?α、IFN?γ及IL?10的AOD計(jì)數(shù)結(jié)果

與對(duì)照組比較，，糖尿病合并肺結(jié)核組TNF?α AOD值明顯降低（P<0.01）；與肺結(jié)核組比較，TNF?α在糖尿病合并肺結(jié)核組也明顯降低（P<0.01）；與肺結(jié)核組比較，IFN?γ在糖尿病合并肺結(jié)核組AOD值降低（P<0.05）；與對(duì)照組比較，IL?10在肺結(jié)核組及糖尿病合并肺結(jié)核組的AOD值均降低（P<0.05）；與肺結(jié)核組比較，IL?10在糖尿病合并肺結(jié)核組的AOD值增高（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

在宿主抗結(jié)核免疫中，TNF?α協(xié)同IFN?γ募集巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞到結(jié)核病灶，并與IL?3通過(guò)嗜中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞作用使炎性反應(yīng)局部化而發(fā)揮抵抗結(jié)核桿菌感染作用。IL?10能增加精氨酸酶1的活性使氮中間體明顯減少，從總體上減弱巨噬細(xì)胞功能，并且能抑制保護(hù)性細(xì)胞因子TNF?α、IFN?γ的產(chǎn)生，使慢性結(jié)核分支桿菌感染者的肺組織內(nèi)菌體大量復(fù)制［6，7］。而糖尿病在肺結(jié)核中是重要危險(xiǎn)因素，目前已受到人們的廣泛關(guān)注。在Vallerskog等［8］對(duì)糖尿病大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，給予低劑量、低毒性的結(jié)核分枝桿菌氣溶膠感染大鼠后，其白細(xì)胞聚集延遲，結(jié)核分枝桿菌從肺組織到淋巴結(jié)的播散速度也延遲，認(rèn)為這與IFN?γ在早期及中期較低水平相關(guān)，在糖尿病合并肺結(jié)核患者的血清中IFN?γ也明顯降低［2］。由此可見(jiàn)，在結(jié)核分枝桿菌感染的過(guò)程中，細(xì)胞因子對(duì)于機(jī)體的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的，糖尿病患者的Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡可能是導(dǎo)致對(duì)結(jié)核分枝桿菌易感及免疫應(yīng)答延遲，不易清除結(jié)核分枝桿菌的主要原因。

圖1 細(xì)胞因子在肺組織中的表達(dá)情況 免疫組化×200Fig.1 Expression of cytokines in the lung tissue Histochemical staining×200

表1 3組肺組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的AOD計(jì)數(shù)表結(jié)果比較（n，±s）Tab.1 TNF?α，IFN?γ and IL?10AODcount results in lung tissues from three different groups（n，±s）

表1 3組肺組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的AOD計(jì)數(shù)表結(jié)果比較（n，±s）Tab.1 TNF?α，IFN?γ and IL?10AODcount results in lung tissues from three different groups（n，±s）

Compared with control group，1）P<0.05，2）P<0.01；compared with tuberculosis group，3）P<0.01，4）P<0.05.

Group n TNF?α IFN?γ IL?10Control group 13 0.224±0.064 0.242±0.015 0.185±0.049Tuberculosis group 45 0.283±0.075 0.292±0.067 0.115±0.0391）Tuberculosis with diabetes group 15 0.118±0.0502），3） 0.190±0.0684） 0.169±0.0571），4）

本研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者病灶中的TNF?α、IFN?γ的水平較對(duì)照組升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能是因?yàn)閷?duì)照組的標(biāo)本均來(lái)自炎性假瘤、支氣管擴(kuò)張及曲球菌感染等炎性反應(yīng)性疾病，所以參與炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子TNF?α、IFN?γ的水平也有所升高，從而使兩組間的差異性降低。其結(jié)果可以說(shuō)明TNF?α、IFN?γ在維持和促進(jìn)局部肺結(jié)核肉芽腫形成過(guò)程中的重要作用，與Bai等的研究結(jié)果一致［9］。TNF?α、IFN?γ的高表達(dá)，提示Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)限制結(jié)核分枝桿菌的局部作用。而本研究中IL?10的水平在肺結(jié)核組較對(duì)照組降低，可以得出肺結(jié)核患者IL?10的缺失與低下將促進(jìn)Th1型細(xì)胞相關(guān)因子的分泌及TNF?α的表達(dá)的推論，并且這一推論在Higgins等［10］對(duì)敲除小鼠IL?10基因的模型中得到同樣證實(shí)。本研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并肺結(jié)核患者病灶中TNF?α、IFN?γ的水平較單純肺結(jié)核組和對(duì)照組顯著降低，糖尿病合并肺結(jié)核患者體內(nèi)的Th1型細(xì)胞免疫功能受損，免疫應(yīng)答反應(yīng)延遲，不利于機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌清除；而糖尿病合并肺結(jié)核組IL?10較肺結(jié)核組升高，IL?10的高表達(dá)使結(jié)核分枝桿菌逃離宿主的免疫監(jiān)視，使糖尿病患者的肺結(jié)核感染病程遷延，糖尿病這一因素在肺結(jié)核的局部免疫中起抑制性作用，其免疫功能低下的原因可能是TNF?α等先天性免疫細(xì)胞因子及IFN?γ等Th1型細(xì)胞因子減少，IL?10等Th2型細(xì)胞因子升高而導(dǎo)致局部細(xì)胞免疫功能減弱所致。而糖尿病患者的Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡，可能是導(dǎo)致其易患肺結(jié)核的重要原因之一。

綜上所述，肺結(jié)核患者的結(jié)核病灶中TNF?α、IFN?γ的高表達(dá)對(duì)于促進(jìn)肺結(jié)核局部炎性反應(yīng)起著重要作用，而糖尿病合并肺結(jié)核患者的TNF?α、IFN?γ的低表達(dá)及IL?10的高表達(dá)，表明了糖尿病在肺結(jié)核發(fā)病過(guò)程中抑制細(xì)胞免疫功能，糖尿病患者Th1/Th2失衡將導(dǎo)致機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝抗菌防御能力減弱。因此，進(jìn)一步調(diào)控TNF?α、IFN?γ及IL?10表達(dá)，有可能成為提高糖尿病合并肺結(jié)核患者免疫功能（特別是局部的免疫功能）的一種新途徑。

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（編輯 武玉欣）

The Expression Levelsand Significance of Cytokinesin the Lung Lesions of Tuberculosis Patients with Diabetes Mellitus

ZHANGFang1，YANGFei2
（1.InstituteofRespiratoryDisease，TheFirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China；2.DepartmentofGeriatrics，ChestHospitalofShenyang，Shenyang110044，China）

ObjectiveTocomparecellularimmunefunctionandexploreitssignificanceinpatientswithtuberculosisortuberculosiscombinedwith diabetes.MethodsThe patients were divided into three groups：First group：13patients with benign lung lesions，Second group：45patients with tuberculosis，Third group：15patients with pulmonary tuberculosis and diabetes.Using immunocytochemistry SABCmethod，the expression of TNF?α and IFN?γ and IL?10in the lung lesions tissue were detected and compare the positive cells AODquantitative from every group.Variance analysis was performed after the rank transformation of AODvalues，then the LSDtest was employed for pairwise comparison.ResultsTNF?α，IFN?γ and IL?10is obvious expressed on the inflammatory reaction around the necrotic area.The TNF?α and IFN?γ AODvalues in the group of tuberculosis withdiabetesmellituswaslowerthanthegroupinthetuberculosisgroup（P<0.05）.TheTNF?α andIFN?γ AODvaluesinthegroupoftuberculosis group was higher than the control group（P>0.05）.The IL?10AODvalues in the group of tuberculosis with diabetes mellitus was higher than the group of tuberculosis（P<0.05）.The IL?10AODvalues in the group of tuberculosis was lower than the control group（P<0.05）.ConclusionOur results proved that the cytokines are involved in local immune response to tuberculosis such as TNF?alpha，IFN?gamma，IL?10.In addition，the diabetes patients are in local immune lower response.Regulating the cytokines in local tissue of diabetic patients could be a new method in immuno?therapy.

TNF?α；IFN?γ；IL?10；diabetes；tuberculosis

R521.9

A

0258-4646（2014）04-0313-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1440.010.html

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2010225034）

張放（1965-），男，副教授，博士.E-mail：zhangfang001@yahoo.com

2014-01-28

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-04-2914:39

·論著·