于海生，王寧

（1.重鋼總醫(yī)院超聲科，重慶400084；2.重慶市腫瘤醫(yī)院超聲科，重慶400030）

低強度脈沖超聲促進不同接種密度骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的實驗研究

于海生1，王寧2

（1.重鋼總醫(yī)院超聲科，重慶400084；2.重慶市腫瘤醫(yī)院超聲科，重慶400030）

目的探討低強度脈沖超聲（LIPUS）促進骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）增殖的可行性及篩選骨髓間充質(zhì)干細胞適宜的接種密度。方法選取體外培養(yǎng)第3代兔骨髓間充質(zhì)干細胞接種至20塊6孔板，接種密度分別為4×103/mL，1×104/mL，2×104/mL，4×104/mL，8×104/mL。選用頻率0.6 MHz，強度為0.2 W/cm2的LIPUS每天分別輻照10 min。輻照前、輻照1 d、2 d、3 d、4 d、4 d后觀察細胞生長情況。MTT法檢測LIPUS輻照后各密度組細胞增殖活性并繪制OD值曲線。結(jié)果BMSCs經(jīng)過LIPUS輻照后，較空白對照組細胞集落更為密集，細胞分裂增殖活性明顯活躍。其中以接種密度為2×104/mL輻照后BMSCs增殖活性曲線更加穩(wěn)定，細胞增殖活性明顯高于空白對照組（P＜0.04）。結(jié)論LIPUS輻照一定時間后能夠促進BMSCs增殖，不同的接種密度的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性不一，其中接種密度為2×104/mL細胞增殖活性曲線更加穩(wěn)定，為更加適宜的接種密度。

低強度脈沖超聲；骨髓間充質(zhì)干細胞；細胞接種密度；細胞增殖

目前骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCS）體外培養(yǎng)增殖速度慢，培養(yǎng)條件復(fù)雜，使其在組織工程學(xué)和醫(yī)學(xué)細胞增殖治療學(xué)發(fā)展受到很大限制［1］，同時細胞培養(yǎng)接種密度及生長空間對細胞生長有很大影響作用。因此尋找一種安全高效的技術(shù)手段和選擇適宜的接種密度對體外擴增BMSCs增殖越來越重要。低強度脈沖超聲具有促進細胞快速增殖生物學(xué)特殊作用使其應(yīng)用越來越受到重視［2］。本實驗通過低強度脈沖超聲促進兔BMSCs增殖效應(yīng)的研究，探討LIPUS體外促進BMSCs增殖的可行性，同時篩選后續(xù)實驗BMSCs適宜的接種密度。

1材料與方法

1.1 材料

實驗動物新西蘭大白兔，兔齡3個月，清潔級，體質(zhì)量2～2.4 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。主要試劑α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國），percoll分離液（Pharmacia公司，美國），四甲基偶氮唑藍（MTT）（Sigma公司，美國），六孔板（Sigma公司，美國）。

主要儀器低強度脈沖超聲儀（重慶海扶，中國），全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀ELX800（Bio-Tek公司，奧地利）。

1.2 方法及內(nèi)容

1.2.1 BMSCs的分離、純化及擴增：具體方法和步驟見文獻［3］。

1.2.2 LIPUS輻照不同接種密度BMSCs：將體外分離培養(yǎng)第3代的BMSCs分別以4×103/mL，1×104/mL，2×104/mL，4×104/mL，8×104/mL接至20塊6孔板中，每個密度組4塊板，每塊板各孔接種密度相同，第一排3個孔為低強度脈沖超聲輻照組（LIPUS組），另外3個孔為空白對照組。輻照方式為每塊板培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，采用輻照探頭涂適當(dāng)耦合劑緊貼6孔板底部進行照射。LIPUS選取輻照強度為0.2 W/cm2，每天輻照10 min［3］，輻照后各密度組細胞立即換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)?？瞻讓φ战M進行超聲假照處理。

1.2.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察：觀察記錄各接種密度BMSCs輻照前、輻照后1～4 d細胞生長、增殖及形態(tài)特征與空白對照組比較變化。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖活性：常規(guī)MTT法檢測BMSCs增殖活性，具體方法和步驟見實驗研究［3］。酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量OD值，并繪制各密度組BMSCs的吸光度曲線，觀察比較各密度組和空白對照組OD值變化走向趨勢。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS12.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和分析。組間比較單因素方差分析或studentt檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.04為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 觀察各接種密度組細胞生長情況

輻照前各密度組BMSCs貼壁后均呈長梭形分布生長。隨著LIPUS輻照時間延長，各密度組的細胞生長情況不盡相同。（1）4×103/mL密度組：輻照后各天2組細胞生長均呈散在分布，未見明顯細胞集落，無明顯差異；（2）1×104/mL密度組：輻照1 d后LIPUS組BMSCs即形成小簇狀增生，而空白對照組細胞呈單個貼壁生長。輻照2 d后LIPUS組BMSCs團簇狀集落開始增多，而空白對照組細胞簇狀呈散在分布。輻照3 d后2組細胞集落均呈漩渦狀排列生長，但LIPUS組細胞排列更加緊密，細胞集落更多。輻照4 d后2組細胞生長集落均較為豐富。輻照4 d后鏡下觀察2組細胞生長情況基本相似；（3）2×104/mL密度組：輻照后1，2，3，4，4 d LIPUS組細胞分裂增殖活性均較空白對照組明顯活躍，細胞體積較大，細胞生長速度明顯加快，細胞排列緊密，呈漩渦狀，細胞集落更加密集，某些細胞集落細胞呈緊密重疊排列，但未觀察到細胞間互相接觸抑制情況。鏡下觀察各密度組細胞，其中以2×104密度組細胞生長變化更為顯著；（4）4×104/mL密度組：LIPUS組于輻照后1 d、2 d細胞分裂增殖活性更加活躍，細胞集落排列更加緊密，但3～4 d兩組未見明顯差異；（4）8×104/mL密度組：輻照后1 d～4 d兩組細胞生長未見明顯差異，均成簇狀排列緊密生長、周圍細胞卷曲生長，細胞老化嚴(yán)重（圖1）。

圖1 各密度組輻照后5 d BMSCs×100Fig.1 BMSCs of different seeding density groups 5 d post-irradiation×100

2.2 MTT法檢測細胞增殖活性及繪制細胞增殖曲線

4×103/mL組：兩組BMSCs增殖活性比較在各天均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.04）；1×104/mL組：輻照0 d、1 d、4 d后LIPUS組和空白對照組細胞增殖活性比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.04），2 d、3 d、4 d LIPUS組細胞增殖活性高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.04）；2×104/mL組：輻照1，2，3，4，4 d后LIPUS組細胞增殖活性均明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.04）；4×104/mL組：LIPUS組和空白對照組細胞增殖活性比較在0 d、2～4 d無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.04），輻照1 d后LIPUS組細胞增殖活性高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.04）；8×104/mL組：LIPUS組和空白對照組細胞增殖活性無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.04，圖2）。

圖2 各密度組LIPUS組和空白對照組細胞增殖活性曲線Fig.2 The cell proliferation activity curves of LIPUS and control groups with different seeding density

2.3 LIPUS促進兔BMSCs增殖的適宜接種密度

通過觀察各密度組細胞生長情況及細胞增殖活性曲線，其中以2×104/mL組BMSCs增殖曲線較穩(wěn)定，變化趨勢與空白對照組比較基本相同，輻照后1，2，3，4，4 d細胞增殖活性明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.04）。

3 討論

目前隨著低強度脈沖超聲研究逐漸深入，LIPUS能夠促進多種細胞的增殖，其在細胞生物學(xué)領(lǐng)域的安全高效的作用越來越得到重視［4～6］。同時LIPUS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)應(yīng)用于臨床上骨與軟組織損傷的治療，效果十分顯著［7，8］。

近些年來，骨髓間充質(zhì)干細胞已成為組織工程學(xué)及臨床組織修復(fù)、替代治療學(xué)理想的種子細胞，BMSCs具有多向分化潛能，可在不同細胞誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)下定向分化成為多種組織細胞［9，10］。但隨著研究不斷深入，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)BMSCs采用常規(guī)培養(yǎng)增殖速度無法滿足實驗研究和臨床應(yīng)用需求，并且采取了很多技術(shù)手段來體外擴增BMSCs，但是效果都不夠理想［11］。因此，如何體外大規(guī)模擴增BMSCs來滿足其發(fā)展的需求已成為首要課題。

細胞接種密度及生長空間對細胞生長快慢有很大的影響，適宜的生長密度有利于細胞的快速增殖，接種密度過小，細胞生長緩慢，接種密度過大，影響細胞伸展生長，細胞容易老化，增殖能力下降［12］。同時，由于受到培養(yǎng)瓶底板面積的限制，適宜的BMSCs接種密度更能說明實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性。因此篩選LIPUS輻照BMSCs適宜的接種密度是十分必要的，可為后續(xù)實驗提供技術(shù)依據(jù)。

由此，本研究應(yīng)用前期實驗篩選出最佳參數(shù)的LIPUS輻照不同接種密度的BMSCs。輻照后各天鏡下觀察不同接種密度細胞生長增殖情況，接種密度2×104/mL細胞增殖活性較其他密度組和空白對照組明顯活躍，細胞生長集落更加密集，排列緊密；MTT法檢測細胞增殖活性結(jié)果提示輻照后2×104/mL密度組細胞增殖活性明顯高于空白對照組（P＜0.04）。通過觀察2×104/mL密度組增殖曲線，我們可以看出經(jīng)過LIPUS輻照后的細胞增殖活性曲線和對照組細胞增殖活性曲線變化趨勢基本相同，相比其他密度組細胞增殖活性曲線變化趨勢更加穩(wěn)定，說明接種密度2×104/mL是LIPUS促進BMSCs增殖適宜的接種密度。

綜上所述，低強度脈沖超聲能夠明顯促進體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞增殖，接種密度2×104/mL相比其他密度組BMSCs增殖更加活躍穩(wěn)定，是適宜的接種密度。

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（編輯 裘孝琦）

ExperimentalStudy on the Effectsof Low-intensity Pulsed Ultrasound on the Proliferation of Bone MesenchymalStem CellsatDifferent Densities

YUHai-sheng1，WANGNing2
（1.Department of Ultrasound，The General Hospital of Chongqing Steel Company，Chongqing 400084，China；2.Department of Ultrasound，Chongqing Cancer Hospital，Chongqing 400030，China）

ObjectiveTo investigate the feasibility of promoting bone mesenchymal stem cells（BMSCs）proliferation by low intensity pulsed ultrasound（LIPUS），and screen out the suitable seeding density of BMSCs.MethodsRabbit BMSCs（P3）were seeded in 20 6-well plates and divided into 4 groups according to their seeding density：4×103/mL，1×104/mL，2×104/mL，4×104/mL，8×104/mL.The cells received LIPUS at intensity of 0.2 W/cm2and frequency of 0.6 MHz for 10 min every day.Cell growth was observed under light microscope.Proliferation activity was determined by MTT and the curve of OD pre-irradiation and 1 d，2 d，3 d，4 d，4 d post-irradiation was determined.ResultsCell proliferation of LIPUS groups was significantly more active than that of the control-group with more intensive cell colonies formed in LIPUS groups post-irradiation.The cell proliferation activity was significantly higher than that in the control group（P＜0.04）and the curve of proliferation activity was more stable with seeding density of 2×104/mL after irradiation of LIPUS.ConclusionsLIPUS can promote proliferation of BMSCs.The proliferation activity is different with the seeding density ofBMSCs.The seeding density of2×104/mL is more suitable.

low-intensity pulsed ultrasound；bone mesenchymal stem cells；cell seeding density；cell proliferation

R318

A

0248-4646（2014）04-0344-04

于海生（1984-），男，碩士研究生.

王寧，E-mail：43729046@qq.com

2013-12-30

網(wǎng)絡(luò)出版時間：