南一楠 李 嬌 李澎濤 華 茜△

（1．北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

腦惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%～53%［1］。原人參二醇（PPD）是存在于人參和三七中的達(dá)瑪烷型四環(huán)萜烯皂角苷［2-3］。 20（S）-原人參二醇（aPPD）是人參皂苷經(jīng)過(guò)胃腸道菌群去糖代謝活化后產(chǎn)生的活性成分，具有廣譜抗腫瘤作用。本研究觀察aPPD對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的抑制殺傷作用，探尋其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購(gòu)置于ATCC，培養(yǎng)在含有 10%胎牛血清（FBS，Gibco，NY）的 DMEM（Sigma）中，并加入青霉素和鏈霉素（Gibco-BRL，NY）防治細(xì)菌感染。于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為37℃。細(xì)胞達(dá)到80%密度時(shí)傳代，約3～4 d傳1代，40代之前的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2 藥物與試劑 原人參二醇受贈(zèng)于Pegasus制藥公司（Vancouver，BC），存儲(chǔ)液用純乙醇配制，濃度為80mmol/L，于4℃避光保存。使用時(shí)溶解于完全培養(yǎng)基內(nèi)，配制成所需終濃度。一抗anti-pro-caspase3（ab cam，ab47131，US）和 anti-PARP （Proteintech，13371-1-AP，US）均按 1∶1000稀釋， 溶解于 3%BSA的TBST中，4℃孵育過(guò)夜。

1．3 細(xì)胞活力檢測(cè)（MTS法） U87細(xì)胞接種于96孔板上，接種密度為每孔 2．5×104個(gè)，100 μL 每孔。 接種24 h后吸去培養(yǎng)基，重新添加新的含藥培養(yǎng)基。作用指定時(shí)間后，向每孔中加入20μLCellTiter 96 AQueous One Solution Reagent（Promega），于 5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，之后于490 nm處測(cè)量吸光度值，數(shù)值越大說(shuō)明細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1．4 蛋白提取與免疫印跡 藥物作用到指定藥物作用時(shí)間后，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕輕清洗細(xì)胞表面1次，之后加入上樣緩沖液 ［62．5mmol/L Tris-HCl，2%SDS，10%甘油，50mmol/LDTT，0．01%（w/v）溴酚藍(lán)］，用細(xì)胞刮輕輕將裂解產(chǎn)物刮下，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)99℃加熱5min，之后離心，待蛋白冷卻后即可上樣。等量的蛋白上樣于SDS-PAGE膠上，待蛋白根據(jù)分子量大小分離開(kāi)后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜 （BIO-RAD），采用NC膜，100 V轉(zhuǎn)1.5 h后將膜取出，于5%脫脂牛奶中封閉1 h后加入一抗4℃孵育過(guò)夜。次日吸走一抗，將膜用TBST洗3遍，每遍15min。之后選擇相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育，室溫在搖床上孵育1 h，同樣用TBST清洗3遍，15 min每次。采用 ECL顯影液 （Perkin-Elmer Life Sciences，Boston，MA）進(jìn)行檢測(cè)，拍攝圖像后用 Image J進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用 One-way ANOVA 比較。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTS法檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。用不同濃度的aPPD處理U87細(xì)胞，24 h后用MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10μmol/L濃度的aPPD即對(duì)U87細(xì)胞有顯著的抑制作用，且隨aPPD濃度升高抑制作用愈明顯（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 不同濃度aPPD作用U87細(xì)胞24h后的MTS測(cè)定結(jié)果（±s）

表1 不同濃度aPPD作用U87細(xì)胞24h后的MTS測(cè)定結(jié)果（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

aPPD劑量 n 0μmol/L（對(duì)照組） 3 10μmol/L 3 20μmol/L 3吸光度值2.32±0.12 1.84±0.08**1.47±0.06**40 μmol/L 3 1.04±0.07**60 μmol/L 3 1.05±0.16**80 μmol/L 3 0.72±0.10**

2.2 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果 不同濃度的aPPD作用于U87細(xì)胞后8 h，免疫印跡結(jié)果顯示pro-caspase3隨aPPD濃度升高呈逐漸減少趨勢(shì) （圖1）。利用Image J進(jìn)行定量分析其條帶光密度與β-actin的比值，結(jié)果可知40μmol/L以上濃度的aPPD會(huì)使pro-caspase3含量明顯下降（表2）。免疫印跡結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PARP有切割條帶的產(chǎn)生（圖2），說(shuō)明當(dāng)U87收到aPPD作用時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)部的caspase3被激活。

圖1 不同濃度aPPD作用于U87細(xì)胞8h后pro-caspase3的變化

3 討 論

大量研究發(fā)現(xiàn)，PPD及其衍生物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷性，并且對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)害［4-6］。aPPD對(duì)肝癌、肺癌以及黑色素瘤細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制和殺傷作用［7］，并且能夠誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，治療白血病［8］。

表2 aPPD作用于U87細(xì)胞8 h后pro-caspase3的變化情況（±s）

表2 aPPD作用于U87細(xì)胞8 h后pro-caspase3的變化情況（±s）

aPPD劑量 n 0μmol/L（對(duì)照組） 3 10μmol/L 3 20μmol/L 3 pro-caspase3/actin 1.00±0.00 0.95±0.13 0.90±0.10 40 μmol/L 3 0.74±0.12*60 μmol/L 3 0.64±0.17**80 μmol/L 3 0.51±0.04**

圖2 不同濃度aPPD作用U87細(xì)胞后PARP的表達(dá)變化

關(guān)于其機(jī)制研究也廣泛展開(kāi)，一項(xiàng)在體研究表明，20（S）-PPD對(duì)肝癌大鼠模型具有顯著療效，能夠抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成，降低微血管密度，并促進(jìn)其凋亡［9］，其分子機(jī)制可能與抑制腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)有關(guān)［10］；另一方面，它還能提高小鼠特異性和非特異性免疫功能［11］。有研究表明，Rh2的作用機(jī)制主要為 caspase 家族的激活［6，12］，Rh2 還與活性氧生成和 p21 活力有關(guān)［13-14］。

20（S）-PPD具有與Rh2相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其殺傷腫瘤的作用機(jī)制尚未完全明確，因此筆者猜想其也有可能與caspase3的激活有關(guān)。caspase家族是一類存在于細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，可以切割肽鏈上天冬氨酸之后的肽鍵，具有高度的特異性［15］。它們廣泛參與細(xì)胞凋亡的各個(gè)過(guò)程，因此越來(lái)越多地在腫瘤治療領(lǐng)域受到關(guān)注。包含凋亡起始者（caspase2、8、10）和凋亡執(zhí)行者（caspase3、6、7），caspase3 和 caspase7 具有相似的底物［16］，會(huì)降解 PARP、DFF-45 等，導(dǎo)致 DNA 修復(fù)抑制以及降解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。

細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，aPPD對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較好的殺傷作用，免疫印跡結(jié)果證明caspase3前體隨aPPD濃度增高而減少，具有明顯的相關(guān)性。而caspase3常見(jiàn)的底物PARP也被切割，說(shuō)明U87細(xì)胞內(nèi)caspase3被aPPD誘導(dǎo)激活，從而進(jìn)入凋亡狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)aPPD誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡的途徑可能與caspase3的激活有關(guān)，然而天然提取物往往具有多靶點(diǎn)、多通道的作用機(jī)制，aPPD是否還具有其他殺傷腫瘤細(xì)胞的作用途徑，其如何激活caspase3等問(wèn)題，尚待進(jìn)一步深入研究。

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