賈 妮 孫曉紅

（陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712000）

腦卒中是多種腦血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，具有極高的致殘率和較高的致死率［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）用于腦中風(fēng)和中樞神經(jīng)退性行疾病等的治療已經(jīng)進(jìn)行了很多的研究［2-4］。本研究試圖觀察中藥復(fù)方補(bǔ)陽還五湯干預(yù)下MSCs移植對于缺血性大鼠模型神經(jīng)修復(fù)的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞提取及培養(yǎng) 選 Wistar大鼠 3只，4～6周齡，體質(zhì)量（100±10）g，雌雄不限。大鼠麻醉后，從關(guān)節(jié)兩端剪斷股骨，將股骨中間剪斷，用注射器吸取低糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，沖出骨髓。制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液離心，接種在培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中。利用差異貼壁培養(yǎng)法純化細(xì)胞，按1∶3傳代。用PBS洗滌細(xì)胞1～2次，加入trypsin-EDTA溶液，放入37℃培養(yǎng)箱2～3min，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用。補(bǔ)足3n（n為傳代瓶數(shù)）mL培養(yǎng)基（MEM），依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱。

1．2 分組及造模 實(shí)驗(yàn)共分4組：空白組，假手術(shù)組，干細(xì)胞移植組及藥物干預(yù)移植組。其中干細(xì)胞移植組及藥物干預(yù)移植組均給予干細(xì)胞移植。模型制備方法包括10%水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射麻醉動(dòng)物。大鼠仰臥位固定，頸部正中切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）。分離至頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）分叉后一段，置線備用。于頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈處用動(dòng)脈夾夾閉，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，將尼龍線由頸外動(dòng)脈插入，插入后用0號(hào)絲線結(jié)扎，打開頸內(nèi)動(dòng)脈處動(dòng)脈夾，將尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度約（18.5±0.5）mm至微感阻力，使尼龍線頭端通過MCA起始處，到達(dá)較細(xì)的大腦前動(dòng)脈，此時(shí)即實(shí)現(xiàn)右側(cè)大腦中動(dòng)脈的血流阻塞，結(jié)扎ICA以固定尼龍線和防止出血，尼龍線殘端留1 cm長于皮外。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線栓。手術(shù)過程中室溫保持在24～25℃。假手術(shù)組不插入尼龍魚線，其余步驟同手術(shù)組。在缺血期間保持體溫在（37±0.5）℃。模型成功的標(biāo)志為以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 干細(xì)胞移植 在MCAO模型制作后，立體定向注入BMSC干細(xì)胞，通過大鼠立體定向儀注入。24 h后重新麻醉，將其固定于立體定向架上，頂部正中切開皮膚，于前囟向左側(cè)旁開2mm鉆孔。將Hamilton微量注射器固定在立體定向架上，細(xì)胞在不少于10min內(nèi)緩慢注射到左側(cè)紋狀體區(qū) （AP=0mm，ML=2.0mm，DV=4.5mm）和大腦皮層（AP=0mm，ML=2.0mm，DV=2.0mm）。每只大鼠接受 10μL（5×104細(xì)胞/μL）移植細(xì)胞，其中紋狀體區(qū)7μL，大腦皮層3μL，留針5min防止細(xì)胞逆流，拔出注射器，醫(yī)用生物蛋白膠封閉注射針孔。

1.4 DiI熒光示蹤劑標(biāo)記 BMSCs細(xì)胞移植前以1000 r/min低速離心5min，收集細(xì)胞后避光加入5μM的DiI熒光示蹤劑，避光室溫孵育20min，PBS洗2次。調(diào)整細(xì)胞密度5×106個(gè)/100μL準(zhǔn)備移植。

1.5 藥物處理 補(bǔ)陽還五湯：黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，芍藥 5 g，地龍 3 g，川芎 3 g，紅花 3 g，桃仁 3 g。 水煎 100 mL。按大鼠每日每千克體質(zhì)量1.5 g計(jì)算藥量。均于術(shù)前1 d及術(shù)后麻醉清醒后，每日分2次灌胃給藥（2mL左右）或蒸餾水2mL，上、下午各1次。模型組和治療組動(dòng)物若有死亡，及時(shí)補(bǔ)充。

1.6 GAP-43定量Q-PCR的檢測 提取總RNA，設(shè)計(jì)引物：上游引物5′-AGCTCTAGATGAAGCCAAACCT，下游引物：5′-ATCTGAGAAAGGGCAGGAGAGA。反應(yīng)體系如下。cDNA：5μL上下游引物各0.5μL；2x SYBRGreen PCRMasterMix 10μL，加雙蒸水至 20μL。PCR反應(yīng)條件如下。預(yù)變性：95℃，5min。變性：95℃15 s，退火 60 ℃，15 s，延伸 72°3 s，共 40 個(gè)循環(huán)。 內(nèi)參片段：GAPD Hr RNA-112 bp。目的片段：GAP-43-150 bp，溶解曲線分析溫度60～95℃，

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSE陽性率分析 見表1。將石蠟包埋切片免疫熒光照相，將圖片轉(zhuǎn)成灰度圖像，8位或精度更高的16位，32位。求Area的面積，求IOD的光密度值，計(jì)算IOD/Area（取2張片均值）。干細(xì)胞移植組與藥物干預(yù)移植組在2、7 d時(shí)組間比較有顯著差異（P＜0.05）。

表1 各組免疫熒光檢測樣品神經(jīng)元陽性率（±s）

表1 各組免疫熒光檢測樣品神經(jīng)元陽性率（±s）

與干細(xì)胞移植組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 12 h 2 d 7 d空白組 1.02±0.03 1.15±0.03 1.02±0.03假手術(shù)組 0.92±0.03 1.04±0.09 1.03±0.08干細(xì)胞移植組 0.57±0.02 0.60±0.03 0.65±0.01藥物干預(yù)移植組 0.68±0.03 0.85±0.03* 0.88±0.02*

2.2 各組缺血區(qū)GAP-43基因表達(dá) 見表2。檢測不同組別3組GAP-43基因的Ct值，與內(nèi)參基因片段GAPDHct值進(jìn)行比較， 得出△Ct與△△Ct，△Ct=（目的基因Ct-內(nèi)參Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。干細(xì)胞移植組與藥物干預(yù)移植組比較，GAP-43基因表達(dá)12 h、2 d時(shí)增高，7 d時(shí)下降，組間比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組缺血區(qū)GAP-43基因表達(dá) （±s）

表2 各組缺血區(qū)GAP-43基因表達(dá) （±s）

組 別 12h △Ct/△△Ct 2d △Ct/△△Ct 7d △Ct/△△Ct空白組 21.02±0.45 0±0.45 20.89±0.15-0.13±0.15 20.97±0.43-0.05±0.43假手術(shù)組 20.83±0.18-0.19±0.18 20±0.03 -1.01±0.03 19.87±0.05-1.15±0.05干細(xì)胞移植組 19.17±0.27-1.84±0.27 18.78±0.18-2.23±0.18 16.65±0.13-4.36±0.13藥物干預(yù)移植組 17.48±0.14-3.54±0.14 15.98±0.14-5.03±0.14 18.59±0.41-2.43±0.41

3 討 論

缺血性腦血管疾病多歸屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)“范疇，益氣活血化瘀法是治療中風(fēng)病重要及常用的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （MSCs），作為神經(jīng)移植的來源細(xì)胞，骨髓MSCs具有獨(dú)特的優(yōu)越性，GAP-43廣泛分布于神經(jīng)元內(nèi)，在發(fā)育中的神經(jīng)元沿整個(gè)軸突表達(dá)，在生長錐表達(dá)尤其豐富，是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個(gè)內(nèi)在決定因子，對突觸的可塑性具有重要意義［2，5-9］。本研究顯示缺血發(fā)生后，移植組7 d后GAP-43基因上調(diào)達(dá)到高峰，補(bǔ)陽還五湯干預(yù)下，2 d后GAP-43基因表達(dá)達(dá)到高峰，因此更早的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的開始，而藥物干預(yù)下各時(shí)間點(diǎn)，神經(jīng)元陽性率都明顯高于單純移植組。

氣虛與血瘀是中風(fēng)病理過程中的關(guān)鍵證候因素。補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)治療中風(fēng)的經(jīng)典方劑，以益氣活血為組方原則。有研究也表明，補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植可以明顯改善缺血再灌注大鼠的腦梗死面積，神經(jīng)功能缺損［10-11］。本研究表明補(bǔ)陽還五湯干預(yù)骨髓MSCs移植，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的再生，修復(fù)損傷的神經(jīng)，進(jìn)一步改善神經(jīng)功能的恢復(fù)。其機(jī)理可能與上調(diào)GAP-43基因表達(dá)有關(guān)。

［1］ 饒名俐.中國腦血管病防治指南［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：11-15

［2］ Mahmood A，Lu D，Chopp M.Marrow stromal cell transplantation after traumatic brain injury promotes ceelular proliferation within the brain［J］.Neurosurgery，2004，55（5）：1185-11931.

［3］ Li Y，Chen J，Wang L，et al.Intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells in a 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson’s disease［J］.Neurosci Lett，2001，316（2）：67-701.

［4］ Wu S，SuzukiY，Ejiri Y，etal.Bonemarrow stromal cells enhance differen tiation of cocultured neurosphere cells and promote regenerationofinjured spinalcord［J］.JNeurosciRes，2003，72（3）：343-3511.

［5］ Woodbury D， Schwarz EJ，Prockop DJ，et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.JNeurosciRes，2000，61（4）：364-370.

［6］ Friedenstein AJ，Gorskaja JF，Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs［J］.Exp Hemator，1976，4：267-2741.

［7］ Benow itz LI，Routtenberg A.GAP-43： an intr insic determinantofneuronal deve lopmentand plasticity［J］.Trends Neurosci，1997，20（2）：84-91.

［8］ Strittmatter SM，Vartanian T，F(xiàn)ishman MC.GAP-43 asaplastic-ityprotein in neuronal form and repair［J］.JNeurobiol，1992，23（5）：507-520.

［9］ InocourtC，Ga llagher SE，Thompson SM.Injury-induced axonal sprouting in the hippocampus is initiated by activation of trkB receptors［J］.Eur JNeurosci，2006，24 （7）：1857-1866.

［10］張運(yùn)克，車志英，梅雪蕊.補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)及腦梗死體積的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010，53（2）：366-368.

［11］張運(yùn)克，車志英，梅雪蕊.補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血再灌注模型神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（8）：1660-1662.