陳琇萌，俞小敏，張惠麗

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科 510120)

梗阻性腎病可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化，慢性腎衰竭的進(jìn)展與腎小管間質(zhì)損害和纖維化關(guān)系密切。梗阻性腎病常合并腎小管酸中毒，腎小管酸中毒不但加劇腎結(jié)石的形成、導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境紊亂，而且進(jìn)一步加重腎小管間質(zhì)損害和纖維化，加速腎功能衰竭。本研究通過觀察單側(cè)輸尿管梗阻(UOO)合并腎小管酸中毒的小鼠模型整合素連接激酶(ILK)的表達(dá)，了解腎小管間質(zhì)纖維化的啟動(dòng)機(jī)制及加重因素，探討腎小管酸中毒在梗阻性腎病中誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 Western blot和免疫組織化學(xué)法的MMP-9抗體和ILK抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學(xué)二抗(小鼠抗兔)購自美國Dako公司，免疫發(fā)光二抗(山羊抗兔)購自美國Cell Signaling 公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立與分組 實(shí)驗(yàn)大鼠由廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，75只清潔級(jí)成年雄性大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量150～220 g，分為假手術(shù)組(對(duì)照，n=25)和UUO組大鼠(n=50)。建立UUO組模型[1](3%水合氯醛腹腔麻醉30 mL/kg)。假手術(shù)組除不結(jié)扎輸尿管外，其余步驟與UUO組相同。檢測(cè)小鼠血、尿鉀和pH值、尿液中可滴定酸和銨離子、尿二氧化碳分壓(PCO2)/血PCO2值，于術(shù)后第7天篩選出腎小管酸中毒組(UUO1組,n=31)和非腎小管酸中毒組(UUO2組,n=19)，分4個(gè)時(shí)期(7、14、21、28 d)處死各組大鼠，取左側(cè)部分腎組織置于10%甲醛中，并予石蠟包埋；其余腎組織液氮冰凍，置于-80 ℃保存。

1.2.2血、尿生化檢測(cè) 采用生化法檢測(cè)血、尿鉀和pH值、尿液中可滴定酸和銨離子、尿PCO2/血PCO2值。

1.2.3腎組織病理學(xué)檢查 石蠟組織切片作HE、PAS和Masson染色。采用百分比評(píng)分法評(píng)估腎小管損傷程度，計(jì)算30個(gè)高倍視野(×400)腎皮質(zhì)中出現(xiàn)損害(腎小管擴(kuò)張、管型、壞死或小管炎、萎縮)的腎小管數(shù)目及總腎小管數(shù)，以損害的腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)的百分比表示。

1.2.4Western blot法檢測(cè)腎組織ILK、纖粘連(FN)蛋白的表達(dá)水平 (1)蛋白質(zhì)抽提、聚丙烯胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜。(2)硝酸纖維素(NC)膜置于50 g/L牛奶-TBS溶液中室溫封閉1 h，加入1∶2 000抗大鼠一抗，室溫孵育1 h，1 g/L TBS-Tween溶液洗滌3次，再加入1∶2 000 HRP-conjugated二抗，室溫孵育1 h，1 g/L TBS-Tween溶液洗滌3次，TBS溶液洗滌5 min，Lumi-GLO室溫孵育1 min，暗房中沖洗膠片。(3)半定量方法分析腎組織中ILK、FN蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1光鏡下腎臟病理改變 與假手術(shù)組相比，UUO2組術(shù)后7 d腎間質(zhì)炎癥加重，集合管、腎小管水腫、擴(kuò)張；14、21 d腎小管基底膜開始增厚、上皮細(xì)胞腫脹、變性，后期腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化改變；28 d時(shí)質(zhì)內(nèi)有大量肌成纖維增生和纖維結(jié)締組織形成，腎小管全程擴(kuò)張，上皮細(xì)胞萎縮。UUO1組在各期病較UUO2組炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化加重，28 d時(shí)基本無正常結(jié)構(gòu)的腎小球。

2.2大鼠腎組織ILK與FN蛋白的表達(dá) UUO2組大鼠腎組織中可檢測(cè)到FN蛋白的沉積和ILK的表達(dá)，UUO1大鼠腎組織FN蛋白的沉積和ILK的表達(dá)高于UUO2組。假手術(shù)組僅有少量的ILK蛋白表達(dá)，幾乎無FN蛋白的沉積，UUO2組ILK蛋白表達(dá)及FN蛋白的沉積增多，而UUO1組較UUO2組增多。UUO1、UUO2兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)，見圖1。相關(guān)性分析結(jié)果表明，腎組織中ILK的表達(dá)水平與FN蛋白沉積的程度呈正相關(guān)。

1:28 d對(duì)照組；2～5：7、14、21、28 d UUO1組；6～9：7、14、21、28 d UUO2組。

圖1大鼠腎組織ILK和FN蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

梗阻性腎病可致腎小管尤其是其遠(yuǎn)端的管腔負(fù)電位無法維持(電壓依賴型)，使泌氫入管腔的速率減慢，導(dǎo)致非分泌缺陷性酸化功能障礙，即遠(yuǎn)端腎小管酸中毒。臨床表現(xiàn)為尿中可滴定酸和銨離子減少、尿pH上升(>6.0)、血pH下降(正常陰離子間隙的高氯性代謝性酸中毒)、低鉀血癥及鈣磷代謝障礙等。腎小管酸中毒不僅造成內(nèi)環(huán)境的紊亂、泌尿系結(jié)石形成，更可能造成腎小管受損，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)-小管纖維化。腎小管間質(zhì)纖維化是梗阻性腎病進(jìn)展為終末期腎衰竭的最終路徑之一。

在慢性腎衰竭腎間質(zhì)纖維化過程中，會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、生長因子及血管活性物質(zhì)。上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是參與腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一[2]。轉(zhuǎn)分化受多種細(xì)胞因子、生長因子和激素的調(diào)節(jié)，值得強(qiáng)調(diào)的是，TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的過程是在病理狀態(tài)下導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的主要途徑。而目前研究認(rèn)為，梗阻性腎病時(shí)局部和系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)激活細(xì)胞，使浸潤的單核巨噬細(xì)胞及轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)顯著增多。其中構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成FN蛋白在間質(zhì)中大量聚積是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的病理基礎(chǔ)[3]。TGF-β1具有多種生物學(xué)功能，其中以在組織器官免疫以及非免疫損傷后瘢痕和纖維化形成過程中的作用最令人關(guān)注，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的在纖維和結(jié)締組織基質(zhì)發(fā)生過程中最為主要的細(xì)胞因子。TGF-β1的高表達(dá)在腎臟纖維化的形成中的作用已明確，TGF-β1族細(xì)胞因子通過不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，其中Smads家族蛋白是其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要因子[4]。參與TGF2/Smad這一信號(hào)傳導(dǎo)途徑的Smads家族蛋白主要有Smad2、3、4、7。Snail抑制E-鈣黏蛋白破壞上皮細(xì)胞極性,將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成間充質(zhì)細(xì)胞；Snail上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)破壞小管基底膜；國外學(xué)者認(rèn)為Snail和LEF-1轉(zhuǎn)錄抑制的相互作用是TGF2-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的必須因素。而ILK是其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的效應(yīng)分子，介導(dǎo)了TGF2-β1誘導(dǎo)腎小管轉(zhuǎn)分化的各個(gè)關(guān)鍵步驟。

Li等[5]提出TGF-β1-Smad-ILK-EMT軸的存在，ILK在TGF-β誘導(dǎo)的EMT可能起關(guān)鍵作用。ILK能夠調(diào)節(jié)FN蛋白的組裝與沉積，即促使細(xì)胞產(chǎn)生的分泌型FN轉(zhuǎn)分化組裝成不溶的FN而直接沉積于細(xì)胞間隙，以此參與細(xì)胞外基質(zhì)的聚積[6]。ILK是1996年Hannigan以β1整合素胞質(zhì)域?yàn)檎T餌，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的一種具有多種功能的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，ILK能通過與整合素β1亞單位胞內(nèi)域相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(如FN蛋白)的連接[7-8]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與基質(zhì)積聚的相互作用是由ILK介導(dǎo)完成，與腎臟病變程度相關(guān)。ILK能夠直接參與細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及細(xì)胞的生長、分化和基因表達(dá)。在腎間質(zhì)纖維化過程中，ILK是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可能參與腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵步驟。有研究表明，在正常腎間質(zhì)中無或僅有極少量ILK表達(dá)，隨腎間質(zhì)病變程度的加重，ILK表達(dá)量明顯增加，腎小管上皮細(xì)胞病變?cè)街乇磉_(dá)越強(qiáng)，萎縮變性的腎小管表達(dá)最為強(qiáng)烈[10]。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，合并腎小管酸中毒的UUO大鼠較未合并腎小管酸中毒的UUO大鼠腎組織ILK蛋白的表達(dá)與FN蛋白的沉積上升。因此認(rèn)為梗阻性腎病合并腎小管酸中毒，加速了腎小管間質(zhì)纖維化，與ILK的高表達(dá)及FN蛋白的沉積相關(guān)。本研究探討的腎小管酸中毒通過上調(diào)ILK介導(dǎo)梗阻性腎病FN蛋白沉積的成因，不僅有利于認(rèn)識(shí)梗阻性腎病合并腎小管酸中毒導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的啟動(dòng)機(jī)制及加重因素，而且有助于在此基礎(chǔ)上發(fā)展防治梗阻性腎病的新措施。

[1]Morrissey J,Hruska K,Guo G,et al.Bone morphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(Suppl 1):S14-21.

[2]Bums WC,Kantharidis P,Thomas MC.The role of tubulaf epithelial-mcsanchymal transition in progressive kidney disease[J].Ceils Tissues Organs,2007,185(1/3):222-231.

[3]Fioretto P,Mauer M.Histopathology of diabetic nephropathy[J].Semin Nephrol,2007,27(2):195-207.

[4]Li Y,Yang J,Dai C,et al.Role for integrin-linked kinase in mediating tubular epithelial to mesenchymal transition and renal interstitial fibrogenesis[J].J Clin Invest,2003,112(4):503-516.

[5]Li Y，Tan X，Dai C，et al．Inhibition of intern-linked kinase activity reduces renal interstitial fibrosis[J]．J Am Soc Nephrol,2009，20(9):1907-1908.

[6]HeF,YuL,TongJR,etal.Roleofintegrin-linkedkinaseinrenaltubularepithelial-mesenchymaltransitionandtheregulatoryeffectofurokinaseonitsexpressioninmicewithobstructivenephropathy[J].Nan

Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2009,29(5):909-913.

[7]Kanasaki K,Kanda Y,Palmsten K,et al.Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus[J].Dev Biol,2008,313(2):584-593.

[8]Liu BC,Li MX,Zhang JD,et al.Inhibition of integrin-linked kinase via a siRNA expression plasmid attenuates connective tissue growth factor-induced human proximal tubular epithelial cells to mesenchymal transition[J].Am J Nephrol,2008,28(1):143-151.

[9]Li Y,Tan X,Dai C,et al.Inhibition of integrin-linked kinase attenuates renal interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(9):1907-1918.

[10]Friedrich EB,Liu E,Sinha S,et al.Integrin-linked kinase regulates endothelial cell survival and vascular development[J].Mol Cell Biol,2004,24(18):8134-8144.